PREPARATUL MICROSCOPIC PERMANENT

Se obtine in urma unor operatii complexe si permite examinarea la microscopul optic a principalelor caracteristici ale celulelor si a modului lor de organizare.

Reprezinta examenul unor celule fragmente de tesut sau organ , carora li s-au suprimat procesele vitale prin fixare.

Un preparat microscopic este alcatuit din:

1. obiect de examinat subtire si transparent
2. mediu de fixare transparent
3. lama si lamela

Scopul relizarii unui preparat microscopic permanent este de a conserva structurile celulare si raporturile dintre ele pe un timp nelimitat.

Este folosit in :

clinica

laborator de anatomie patologica

medicina legala

cercetare

in scop didactic

TIMPII:

1. Recoltare
2. Fixare
3. Spalare
4. Includere
5. Sectionare
6. Colorare sau impregnare
7. Montare
8. Etichetare

1.RECOLTAREA

Este operatia prin care obiectul de examinat este prelevat de la omul sau animalul viu sau dupa sacrificarea animalului sau de la cadavru.

1. Recoltarea bioptica se recolteaza de la om sau animalul viu si se practica in scop diagnostic. Se realizeaza prin :

raclare

punctie bioptica

aspiratie

interventie chirurgicala

2. Recoltarea necroptica - dupa sacrificarea animalului si se practica in laboratoare in scop de cercetare sau didactic. Recoltarea de la cadavrele umane se practica in laboratoarele de amatomie patologica si medicina legala in scopul de a confrunta datele de anatomie clinica si tanatogenetice.

Dupa recoltare in cazul organelor cavitare , acestea se golesc de continut prin injectarea unei sol. de fixator.

In cazul organelor retractile cum ar fi muschiul vasele, tendonul piesele se fixeaza prin doua ligaturi pe o bagheta de sticla sau de lemn.

Conditiile unei bune recoltari:

1. cat mai aproape de momentul decesului pentru a evita procesele de autoliza.
2. dimensiunea piselor sa nu depaseasca 5 mm
3. calitatea instrumentelor - bine ascutite pentru a evita zdrentuirea si pierderea paralelismului dintre planuri
4. adecvat in functie de tipul organului ; se vor evita modificarile de volum, forma si relief.

2. FIXAREA

Este o etapa decisiva in obtinerea unui preparat microscopic permanent.

Este un proces fizic sau chimic prin care sunt oprite cat mai rapid procesele vitale celulare pastrandu-se cu alterari minime volumul forma , relieful si raporturile spatiale si moleculare .

Se realizeaza cu ajutorul fixatorilor.

Prin fixare urmarim

1. Conservarea tesuturilor pentru a impiedica aparitia proceselor de putrefactie si autoliza
2. Prevenirea pierderii de constituenti celulari
3. Cresterea diferentierii optice a structurilor celulare in scopul realizarii unei coloratii selective
4. Marirea consistentei tesuturilor in scopul de a facilita trecerea lor prin celelalte etape ale tehnicii si mai ales pentru sectionare.

FIXATORII POT FII:

1. Dupa natura lor:

fizici

chimici

2. Dupa reactia pe care o au cu proteinele solubile

coagulanti

necogulanti

Fixatorii chimici:

1. simpli
2. amestecuri fixatoare

Fixatori simpli mai des utilizati

acetona acid tricloracetic , formol , acid osmic , alcool metilic

Amestecuri fixatoare:

Au fost introduse in practica datorita afinitatii inegale pentru diversele elemente structurale ale fixatorilor si a diferentei in puterea lor de penetratie.

1. dupa compozitia chimica
1. apoase
2. alcoolice
2. Dupa scopul urmarit
1. Universale (topografice)
2. Citologice

Pentru preparatele histoenzimologice si histochimice fixarea se face cu ajutorul criostatului.

Mecanismul fixarii:

1. insolubilizarea prin precipitare a unor constituenti celulari proteine , glucide , saruri minerale, lipide
2. formarea de compusi de aditie intre fixator si unii constituenti celulari
3. coagularea proteinelor

Dupa teoria coloidala fixarea este considerata ca fiind trecerea din starea de sol in starea de gel a substantelor albuminoide din tesuturi.

CALITATILE UNUI BUN FIXATOR

1. patrunde bine in tesuturi pentru a opri cat mai brusc procesele vitale
2. stabilizeaza tesuturile pastrand nealterate caracterul si distributia constituentilor celulari
3. nu provoaca artefacte
4. nu deformeaza tesutul
5. nu dizolva constituenti
6. distruge microorganismele
7. extrage enzimele autolitice inactivate
8. confera consistenta
9. produce diferentiere optica
10. nu-si modifica compozitia
11. ieftin , netoxic , neinflamabil , neiritant

Deoarece nu exista un fixator ideal in practica se alege un fixator care sa rezolve cel mai bine scopul propus. Este recomandat sa se foloseasca 2 - 4 fixatori.

TRATAMENTE POSTFIXARE

1. decalcifierea impusa de prezenta sarurilor de Ca in piese care impiedica sectionarea
2. disocierea pieselor pentru a le analiza izolat
3. mordansarea se realizeaza cu substante care duc la ameliorarea colorarii si fixarii

3.SPALAREA

Este procedeul prin care se opreste procesul de fixare prin indepartarea agentului fixator din tesuturi .

In functie de solubilitatea fixatorului spalarea se realizeaza cu :

1. apa pentru fixatori solubili in apa
2. alcool 70-80% pentru cei solubili in alcool

4.INCLUDEREA

Este procedeul prin care se realizeaza conditii optime care sa permita sectionarea piselor in sectiuni subtiri de ordinul mm , transparente si cu fete plane astfel incat sa poata fii examinate la microscop.

Mase de incluziune

1. Dupa modul de realizare al includerii :
1. Penetreaza celula
2. Ramane in spatiul intercelular

2.Dupa solubilitatea in apa

a.  anhidre , ex. parafina , celoidina , paraplastul

b. apoase ,ex . gelatina , polietilenglicol

Cea mai utilizata masa de incluziune este parafina. Acasta nefiind miscibila cu apa presupune niste etape premergatoare includerii:

a.  deshidratare - alcool in concentratii crescande incepand cu 50 , fiecare in 3 bai succesive.

b. clarificare - indepartarea alcoolului din piesa cu ajutorul unor reactivi numiti clarificatori , miscibili cu parafina , care fac ca piesa sa devina translucida. Se efectueaza cu alcool anilic sau cu hidrocarburi benzenice.

c.  impregnare -este operatia de patrundere a piesei pana in cele mai mici interstitii cu parafina topita si solidificarea in bloc prin racire pentru a oferi o consistenta omogena. Ea decurge in termostat la o temperatura cu 2-3 mai mare decat punctul de topire al parafinei utilizate. Ea va fii inglobata intr-un bloc de parafina solida de consistenta omogena.

d. turnarea blocurilor - blocul inglobat se monteaza pe un port-obiect

5. SECTIONAREA

Piesa inclusa sau inghetata se taie in felii subtiri de ordinul micronilor cu ajutorul unui aparat numit microtom.

Elementele componente

suport ptr. cutite

portobiect

capul mobil

micrometru gradat care permite inaintarea portobiectului pe distante foarte mici

Se obtin astfel sectiuni seriate sub forma de panglici.Acestea se etaleaza si se lipesc pe lama portobiect Aceasta se realizeaza cu albumina Mayer.

Sectiunile astfel obtinute se lasa la uscaqt apoi se pun in stativ.

Sectionarea la microtomul ptr. parafina presupune urmatorii timpi pregatitori:

modelarea blocului ptr. Sectionare

lipirea blocului pe portobiect

sectionarea propriuzisa

etalarea si lipirea sectiunilor

6. COLORAREA

Este etapa prin care se urmareste cresterea contrastului intre elementele tisulare sau celulare prin modificarea indicilor de refractie ai substratului morfologic cu ajutorul colorantilor.

Tehnica de colorare depinde de natura fixatorului si de tesutul pe care se aplica.

7.MONTAREA

Este procedeul care are drept scop protejarea sectiunilor fragile de eventualele deteriorari , conservarea coloratiei si asigurarea unui mediu optic omogen si transparent necesar examinarii microscopice.

Se face intre lama si lamela in diferite medii de montare initial fluide.

Mediile de montare pot fii

apoase

a.  glicerina

b. sirop Apathy

anhidre

a.  balsam deCanada

b. colofoniu

Pentru a realiza montarea se foloseste balsamul de Canada 1-2 pic. Pe o lamela de sticla care se intoarce cu fata in jos si se aseazape suprafata sectiunii apasand usor ptr. A preveni aparitia bulelor de aer.

8. ETICHETAREA

Pe fiecare lamela se noteaza

tipul celular

sursa de recoltare

fixatorul

metoda de colorare

data efectuarii

Aceste preparate se pastreaza in cutii sau mape speciale ferite de lumina.