Recoltarea si transportul produselor patologice in vederea examenului microbiologic

Recoltarea produselor patologice in scopul examenului microbiologic reprezinta o etapa extrem de importanta , de corectitudinea careia depinde in mare masura exactitatea diagnosticului. Recoltarea produselor patologice adecvate, in momentul corespunzator, cu respectarea regulilor de asepsie, transportul in conditii optime si cat mai rapid spre laborator sunt absolut necesare .

Principii generale

Recoltarea probelor trebuie facuta de medic sau sub indrumarea acestuia.

Se utilizeaza numai recoltoare sterile, pe care vor fi mentionate datele de identificare: numele pacientului, sectia, produsul si data recoltarii, inainte de a se face prelevarea.

Recoltarea unui produs biologic in vederea evidentierii florei microbiene trebuie efectuata, pe cat posibil, inaintea administrarii tratamentului cu antibiotice .

Din produsul biologic se va recolta portiunea sau fragmentul cu aspect patologic, caracteristic.

Prelevarea trebuie facuta in momentul optim, in sensul posibilitatii prezentei unui numar cat mai mare de microorganisme si in functie de evolutia clinica a bolii.

Cantitatea de produs trebuie sa fie suficienta pentru a permite efectuarea mai multor examene.

Transportul probelor recoltate la laborator trebuie sa fie facut in timp cat mai scurt, pentru a evita modificarile cantitative si calitative ale florei, sub actiunea deshidratarii, modificarilor de temperatura, pH, etc. In probele pastrate prea mult timp, microorganismele mor datorita deshidratarii, temperaturii prea scazute, sau, din contra, unele medii ( urina) sunt favorabile multiplicarii excesive a florei initiale.

In cazul in care transportul poate dura mai mult timp sau nu exista posibilitatea insamantarii imediate a probelor, se folosesc recoltoare cu medii de conservare si transport.

Transportul probelor se va face in containere speciale, inscriptionate cu mentiunea material infectant, manipulate de persoane instruite, evitandu-se rasturnarea containerelor si varsarea materialelor .

Hemocultura

Prelevarea unei probe de sange pentru cultivarea pe medii adecvate -hemocultura- are indicatie in suspiciunea de bacteriemie, septicemie sau endocardita bacteriana. De asemenea hemocultura este indicata in starile febrile prelungite fara o cauza decelabila.

Este foarte important ca punctia venoasa sa fie facuta in conditii de asepsie, folosind pentru dezinfectare pielii la locul punctiei venoase alcool 80-95% si compusi iodati: tintura de iod, betadina , ce vor fi lasati sa actioneze pe piele minim 1 minut. persoana care recolteaza va purta manusi sterile.

Vor fi recoltate cel putin trei probe, fie intr-un interval de 24 h , in suspiciunea de endocardita, fie la intervale de timp determinate de evolutia clinica, in general in plin puseu febril, timp de 2-3 zile consecutiv. O singura proba este insufucuenta pentru stabilirea unui diagnostic corect, indiferent de rezultatul acesteia.

Volumul de sange indicat a se recolta pentru hemocultura este de 20 ml la adult si 1-5 ml la copii, in functie de varsta acestora. Sangele se recolteaza cu seringa si se descarca imediat in mediile de cultura lichide speciale. Se foloseste de regula un set de doua medii de cultura: aerobe si anaerobe. Raportul optim sange: mediu de cultura este de 1: 10 ( flacoanele cu medii pentru hemocultura au in general 100 ml, pentru adulti si 20 ml pentru copii ). In cazul in care pacientii au primit deja antibiotice, exista medii de cultura aerobe si anaerobe cu inhibitori de antibiotice. Totusi este de preferat ca macar primele prelevari sa se faca inaintea instituirii tratamentului antibacterian sau antifungic.

Incubarea hemoculturilor se face la 37⁰ C, timp de 7 zile. In sistem clasic, se fac treceri pe medii solide la fiecare 24 h. Hemocultoarele automate efectueaza citiri cu ajutorul unei fotocelule ce inregistreaza modificarea turbiditatii mediului prin cresterea bacteriana, la intervale de timp de 15-30 minute. Confirmarea pozitivarii hemoculturii precum si identificarea tulpinii izolate se face tot prin trecere pe medii de cultura solide. Daca dupa 7 zile hemocultura nu s-a pozitivat, rezultatul definitiv va fi negativ ( hemocultura sterila ).

Catetere intravasculare

Mentinerea cateterelor intravasculare mai mult de 72h reprezinta o sursa importanta de episoade de bacteriemie si de infectii la locul de insertie al cateterului. Dupa scoaterea cateterului, varful de cateter - segmentul distal, de 3-5 cm, sectionat aseptic si introdus intr-un tub cu capac steril, este trimis la laboratorul de bacteriologie . Aici, peste virful de cateter se toarna 2-3 ml bulion steril, astfel incat sa fie complet acoperit si va fi mentinut astfel 24 h. Din bulion vor fi facute treceri pe medii de cultura solide.

Lichidul cefalorahidian ( L.C.R. )

Examenul lichidului cefalorahidian este indicat in suspiciunea de meningita:febra, cefalee, fotofobie, redoarea cefei, etc.

Recoltarea L.C.R. se face prin punctie lombara, in conditii de asepsie stricta, dupa dezinfectia pielii cu betadina sau alti compusi iodati. Prelevarea se face in seringa, fara a aspira, apoi descarcat in flacoane sterile cu dop, sau-si in medii de cultura lichide pentru hemocultura.

Este de preferat sa existe flacoane diferite: pentru cultura, pentru examenul biochimic si examenul microscopic. Daca nu exista decat un singur flacon, atunci mai intai se efectueaza insamantarea ( cultura), apoi examenul biochimic si cel microscopic.

La examenul macroscopic LCR normal este incolor, limpede, transparent. In meningitele bacteriene apare tulbure, galbui sau verzui. Culturile se fac pe medii solide , dar pot fi facute si in medii lichide de hemocultura, in special la analizorul automat .

Apoi, din L.C.R. se numara elementele ( celulele), in camera de numarat Fuchs-Rosenthal. Valoarea normala a numarului de elemente celulare este mai mica de 5 elemente la 1 ml, acestea fiind in special limfocite. Daca numarul de celule depaseste limitele fiziologice, este necesara efectuarea unu frotiu colorat Giemsa pentru aprecierea raportului dintre mononucleare si polinucleare. In meningitele bacteriene, numarul de celule creste la cateva sute sau chiar mii la 1ml, predominente fiind polinuclearele. In meningitele virale, fungice si in meningita tuberculoasa, numarul de elemente este mai redus si chiar daca in primele ore exista o predominenta a polinuclearelor, ulterior raportul se inverseaza cu predominenta mononuclearelor .

L.C.R. este apoi centrifugat la 1500 g timp de 15 minute. Supernatantul este separat si va fi folosit la examenul biochimic: dozarea proteinelor, glucozei, clorurilor.

Din sediment se efectueaza 2-3 frotiuri, colorate A.M., Gram si la nevioe Ziehl-Neelsen.

Teste imunologice, de detectare a antigenelor bacteriene sau fungice in LCR sunt recomandate arunci cand exista modificari semnificative ale LCR: leucocite, glucoza scazuta, proteine crescute, dar pe frotiu nu se observa florai sau pacientul a fost tratat in prealabil . Pot fi detectate antigene de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophylus influenzae, Streptococcus agalactiae sau Cryptococcus neoformans

Alte lichide normal sterile: lichidul peritoneal, lichidul pleural, lichidul sinovial, lichidul pericardic.

Aceste lichide se recolteaza de regula prin punctie transcutana, in conditii de asepsie riguroasa, in cantitate de 5-20 ml. Fiind produse normal sterile, orice microorganism de pe piele care contamineaza proba duce la rezultate complet eronate. Lichidul peritoneal se poate recolta si intraoperator, cu tamponul steril.

Daca lichidul este purulent, se poate efectua un frotiu colorat Gram direct din produsul patologic. In caz contrar, se fac culturi aerobe si anaerobe.

Bila

Recoltarea bilei se poate face prin tubaj duodenal sau, dupa colecistectomie, direct din vezica biliara cu tamponul steril sau in seringa.

Tubajul duodenal se efectueaza dimineata pe nemancate, cu sonda Einhorn introdusa pe nas sau pe gura, dupa ce bolnavul a facut gargara cu ser fiziologic. Se introduce sonda pana la diviziune 45, apoi se culca bolnavul pe parte dreapta si se continua introducerea sondei pana la diviziunea 60. Se aspira pe sonda initial bila A, bila amestecata cu suc duodenal. Se introduc pe sonda 30 ml solutie de sulfat de magneziu sau sulfat de sodiu 40%, cu efect coleretic si colagog. Se aspira apoi bila B, de culoare verde inchis, vascoasa ( bila veziculara), apoi bila C, mai deschisa la culoare si mai fluida ( bila hepatica). Pentru examenul bacterilogic se foloseste bila B, 10-20 ml.

Din bila B se fectueaza culturi aerobe si anaerobe.

Din esantioane de bila A, B si C se efectueaza preparate intre lama si lamela pentru examenul parazitologic.

Exudatul faringian si exudatul nazal

Exudatul faringian se recolteaza cu tamponul steril, de unica folosinta. Recoltarea se face dimineata pe nemincate, inainte ca pacientul sa se spele pe dinti, sa-si faca toaleta bucala sau sa bea ceva. De asemenea, recoltarea se face inaintea oricarui tratament cu antibiotice sau local ( badijonari cu substante antiseptice, antifungice sau antibacteriene).

Pacientul este asezat cu fata spre lumina , i se indica sa deschida gura cat poate de mult si cu ajutorul unui apasator de limba se preseaza limba astfel incat sa se evidentieze peretele posterior al oro-faringelui si tonsilele palatine. Se examineaza macroscopic rapid oro-faringele si cu o miscare rapida, blinda dar precisa se sterg cu tamponul peretele faringian si tonsilele. Nu se ating peretele superior al palatului si nici limba .( Secretia linguala este o investigatie aparte, cand se recolteaza tot cu tamponul strict de pe suprafata limbii ).

Exudatul nazal se recolteaza in mod similar, cu tampon steril , din fiecare fosa nazala.

Exudatul faringian si cel nazal se transporta la laborator si se insamanteazp in cel mai scurt timp posibil, evitandu-se uscarea tamponului si efectul temperaturii scazute, care duc la moartea florei bacteriene, in special a streptococilor si pneumococilor. Pentru a evita aceste neajunsuri se pot folosi tuburi cu medii de conservare si transport.

Secretiile conjunctivale, otice, secretiile de plaga

Secretia conjunctivala se recolteaza cu tamponul steril, dimineata, inaintea efectuarii toaletei si inaintea aplicarii de coliruri sau de creme oftalmice . Prelevarea se va face din sacul conjunctival intern, eventual cu tamponul umezit in ser fiziologic steril.

Secretia otica se recolteaza cu tamponul steril din conductul auditiv , inainte de aplicare oricarui tratament cu antibiotice sau antiseptice.

Secretiile de plaga se vor recolta cu tamponul steril, inainte de toaleta plagii. Daca plaga este profunda si secretia abundenta, se va recolta cu seringa sterila si o proba pentru cultura in anaerobioza.

Sputa

Sputa poate fi recoltata prin expectoratie intr-un recipient steril (gradat, de unica folosinta). Pacientul este instruit ca dimineata, dupa un acces de tuse , sa expectoreze in recipientul steril, evitand sa amentece sputa cu saliva. Acest lucru este dificil de realizat, principalul neajuns al metodei este ca produsele sunt frecvent contaminate cu flora din cavitatea bucala.

Probele de sputa recoltate in cursul bronhoscopiei sunt ferite de acest inconvenient, contaminarea cu flora bucala fiind practic neglijabila. Aceasta metoda este cea mai recomandabila.

La copiii mici, care nu stiu sa expectoreze si inghit sputa. Aceasta poate fi recoltata prin tubaj gastric urmat de introducerea a 10-20 ml ser fiziologic, urmat de aspiratie. In lichidul aspirat va fi si sputa inghitita, dar micobacteriile si fungii continuti pot fi de origine gastrica

Urina

Recoltarea urinei pentru urocultura este indicata in suspiciunea de infectie urinara. Recoltarea se poate face in mai multe moduri.

In majoritatea cazurilor, urina se recolteaza in timpul primei mictiuni de dimineata, "din mijlocul jetului". Pacientii sunt instruiti ca inainte de prima mictiune sa efectueze o toaleta genitala riguroasa, cu apa si sapun, apoi sa se stearga cu tifon steril, iar femeile care au secretii genitale abundente sa-si introduca un tampon intravaginal. Aceste masuri sunt absolut necesare pentru a evita contaminarea probei de urina cu flora de la nivelul mucoasei genitale.

Recoltarea se face in flacoane steile, de unica folosinta. Pacientul va incepe sa urineze, pentru ca prima portiune a jetului sa elimine flora existenta la nivelul uretrei terminale; apoi va intrerupe voluntar mictiunea; va desuruba flaconul steril si a doua parte a jetului ( mijlocul jetului) o va urina direct in flacon - 2-3 ml. Va astupa flaconul. Va termina mictiunea normal, in toaleta.

La bolnavii care nu-si pot controla mictiunea ( copii mici, adulti inconstienti) si la cei la care oricum se efectueaza sondaj vezical evacuator ( adenom de prostata, etc.) recoltarea urinii pentru urocultura se face pe sonda. Aici exista insa pericolul introducerii in vezica urinara a florei de la nivelul uretrei terminale sau chiar flora exogena.

Punctia suprapubiana transcutanata permite recoltarea unei probe de urina direct din vezica urinara.

Urina fiind un excelent mediu de cultura, ea va fi pastrata la temperatura camaerei maximum 2h pana la insamantare, sau la frigider maxim cateva ore.

Materiile fecale

Materiile fecale se recolteaza in scopul efectuarii coproculturii sau a examenului coproparazitologic.

Coprocultura este indicata in bolile diareice, in febra tifoida si paratifoida si pentru depistarea portajului de enterobacterii obligat patogene. Recoltarea se face in coprorecoltoare sterile, cu mediu de conservare si transport.

La bolnavii cu diaree, materiile fecale se recolteaza din scaunul emis spontan, intr-un recipient steril, fara urme de detergenti sau dezinfectanti. Cu lingurita cu care este prevazut coprorecoltorul special, pacientul va recolta o cantitate mica din proba, in special cu sange sau mucus, daca exista. Proba fa fi introdusa in coprorecoltor, in mediul de conservare si transport Carry-Blair.

Materiile fecale mai pot fi recoltate prin sondal rectal, cu sonda Nelaton , introdusa 10-12 cm la copil si 16-18 cm la adult, si aspirand prin presare la capatul distal al sondai. Aceasta va fi apoi descarcata in ser fiziologic sateril sau in mediu Carry-Blair dun ciprorecoltor.

Pentru suspectii de portaj de enterobacterii patogene, recoltarea meteriilor fecale se va face dupa administrarea unui purgativ salin ( sulfat de sodiu si de magneziu).

Pentru examenul coproparazitologic, recoltarea se face in mod similar, proba introducandu-se intr-un coprorecoltor de unica utilizare fara mediu de conservare si transport.

Secretiile genitale: secretia vaginala si secretia uretrala

Secretia vaginala se recolteaza pe masa ginecologica. Este de preferat ca feneia sa se afle in primele 5-10 zile dupa menstruatie, pentru a evidentia mai bine parazitul Trichomonas vaginalis. Ce tamponul steril se recolteaza secretie din vagin si din fundul de sac posterior, iar dun secretia acumulata pe valva, se depun probe pe 2-3 lame de microscop, pentru preparatul proaspat si pentru frotiuri. Pentru preparatul proaspat lamele si serul fiziologic folosit trebuie tinute la termostat la 37 ^O C, iar examinarea microscopica sa fie facuta in 10-15 minute de la recoltare. Frotiurile se coloreaza Albastru de metilen si Gram. Culturile se fac pe geloza-sange, geloza chocolat , Muller-Hinton sau Thayer-Martin si AABTL.

Secretia uretrala la bolnavii cu uretrite acute este de obicei abundenta. La bolnavii cu uretrite cronice este mult mai redusa. Ea se recolteaza dimineata, inainte de mictiune. Dupa un masaj usor al uretrei anteroare, ca sa se exprime cateva picaturi de secretie ( picatura matinala). Cu un tampon steril se recolteaza pentru cultura, apoi se depune cate o picatura pe 2-3 lame de microscop, pentru examenul direct si pentru frotiuri.

In vederea sepistarii parazitului Trichomonas se poate exmina sedimentul urinar al primului jet de urina recoltat de dimineata.

Scuame cutanate, fire de par

Scuamele cutanate se recolteaza prin raclare usoara, cu o lama de bisturiu, din regiunea periferica a leziunii, apoi se introduc intr-o eprubeta sterila. Firelele de par modificate se recolteaza cu pensa prin smulgere, apoi se introduc intr-o placa petri sterila. Unghiile parazitate se taie cu o foarfece dezinfectata si se introduc intr-o placa petri sterila.

Aceste produse vor fi supuse unor examene micologice si eventual bacteriologice.