Diagnosticul de laborator al intoxicatiei cu antidepresive

Diagnosticul de laborator al intoxicatiei cu antidepresive

screeningul toxicologic

Orice medicament sau substanta adusa de apartinatori, suspectate a fi cauza intoxicatiei, trebuie trimise la laboratorul de toxicologie. Se trimit de asemenea probe dun lichidul de spalatura gastrica, sange, urina.

Analiza toxicologica a sangelui trebuie sa fie cantitativa, pentru a stabili nivelul sanguin al unui anumit toxic. Analiza toxicologica a urinii consta in determinari calitative de o deosebita importanta fiind identificarea toxinelor cu volum mare de distributie, a celor cu inalta liposolubilitate, sau durata lunga de injumatatire.

Totdeauna trebuie comunicat laboratorului de toxicologie ce substanta toxica sau medicament este suspectat, durata de timp de la ingestie, precum si semnele si simptomele principale prezentate de bolnav.

Deoarece screeningul toxicologic negativ nu exclude posibilitatea supradozajului unor medicamente, clinicianul trebuie informat pentru care droguri s-a facut acest screening.

1.Determinarea calitativa a antidepresivelor

Reactii de culoare

pentru amitriptilina si nortriptilina se utilizeaza 3 parti reziduu uscat tratate una cu reactivul Marquis (R 46), care coloreaza reziduul in oranj care apoi trece in maro; unul cu reactivul Frohde care il coloreaza in oranj, iar la adaugarea unei picaturi de apa, trece in verde; al treilea cu reactivul Mandelin il coloreaza in care treptat vireaza in verde. Pentru reziduul provenit din evaporarea la sec a 5 ml extract cloroformic, se adauga 3 ml acid sulfuric H₂SO₄  concentrat colorandu-se in oranj (reziduu stomacal), sau visiniu (reziduu urinar). Se observa o fluorescenta galben-oranj cu o lungime de unda maxima λ de 560 nm pentru amitriptilina, si λ maxim de 586 nm pentru nortriptilina.

Pentru doxepina se utilizeaza 10 ml extract cloroformic la care se adauga 2 ml acid sulfuric H₂SO₄ care se agita energic 10 secunde. Faza organica superioara se va colora in roz iar cea acida inferioara in oranj-roz. Prin iradiere in lumina UV la lungime de unda λ de 366 nm nu apare nici o fluorescenta. In urma reactiei cu acid sulfuric va rezulta un preparat cu culoare rosu-oranj, care examinat la lampa Wood va da o fluorescenta galben-verde.

Pentru imipramina se folosesc 5 ml extract cloroformic, la care se adauga 5 ml eter si dupa agitare energica 2 ml de reactiv fosfoceric (R 40), faza acida colorandu-se in albastru, care trece in verde.

Spectrofotometrie in ultraviolet

pentru amitriptilina si nortriptilina se utilizeaza extract cloroformic din urina ce prezinta in cazul acestor substante nemetabolizate o absorbanta la λ de 240 nm.

Pentru produsii de metabolizare ai amitriptilinei si nortriptilinei se utilizeaza extract cloroformic din faza apoasa a urinei, tratat cu HCl. Acesti compusi prezinta o absorbtie maxima la λ de 240 nm.

Cromatografie in strat subtire

Pentru amitriptilina si nortriptilina, reziduul dizolvat in 0,2-0,5 ml metanol se spoteaza pa placi cu silicagel G. Developarea se face in sistemele de solventi S_1-6 , S₁₀, S₁₁, S₄₁, S₄₂ iar vizualizarea cu reactiv iodoplatinic (R41) sau reactiv Dragendorff (R36) . Pentru separarea amitriptilinei de metabolitii sai se folosesc sistemele de solventi S₆ si S₂₆

Pentru doxepina se folosesc o parte alicota din extractul cloroformic concentrat in prealabil la volum mic, care se spoteaza pe placi acoperite cu un strat silicagel G, activat inainte de folosire timp de o ora la 110⁰ C. Dupa developare in sistemul de solventi S ₂ spoturile sunt vizualizate prin stropirea placilor cu reactiv iodoplatinic acid (R42).

Pentru imipramina o parte alicota din extractul cloroformic este adusa intr-o capsula si evaporata la sec. Reziduul se reia cu 1 ml cloroform din care se spoteaza cate 1 μl pe placi acoperite cu un strat silicagel G, activat inainte de folosire timp de o ora la 110⁰ C. Dupa developare in sistemul de solventi S ₂₈ , S₁₉ , S₆ , S₁₀ , S_20,spoturile sunt vizualizate prin stropirea placilor cu reactiv iodoplatinic acid, Dragendorff (R36), fast blue, si acid percloric 60% care contine 3% solutie nitrit de Na 0,5%.

Fluorometrie

Pentru amitriptilina, nortriptilina si metabolitii lor, se folseste extract organic tratat cu NaOH si dicloretan. Peste reziduu se pipeteaza 3 ml acid sulfuric aparand o coloratie rosie daca extractia s-a facut din lichid gastric si visinie la extractia din urina. Daca se adauga 1 ml formol, la 366 nm se va observa o fluorescenta galben-oranj (λ maxim de emisie pentru amitriptilina este de 560 nm iar pentru nortriptilina 586 nm). Diluand amestecul cu 10 ml apa distilata, se va observa pentru compusii nemetabolizati la 360 nm o fluorescenta verde, (extractie din lichidul gastric) iar pentru metaboliti o fluorescenta albastra (extractie din urina).

2.Determinarea cantitativa a antidepresivelor

Dozarea spectrofotometrica

- pentru amitriptilina si nortriptilina se iau 5 ml ser sau urina alcalinizata la pH 11-12, se extrag cu 25 ml n- hexan, agitand viguros 2 minute. Hexanul este transferat intr-un cilindru gradat cu dop si volumul este completat la 25 ml cu solvent. Se adauga peste hexan, 10 ml reactiv sulfoceric in acid sulfuric 5,5 M si se agita 2-3 minute. 9 ml din extractul acid sunt transferati intr-un balon cu fundul rotund, de 250 ml, peste 5 ml n-heptan. Flaconul este atasat la un refrigerent cu reflux. Se refluxeaza 25-30 minute cu agitare constanta.

Dupa racire heptanul spalat cu apa se citeste la spectrofotometru la 250 nm. Se lucreaza in paralel cu o proba etalon de amitriptilina, luandu-se in lucru 5 ml . Concentratia de toxic se calculeaza cu ajutorul relatiei:

Conc. mg % = A_p/A_e x C_e, unde

A_p absorbanta probei de analizat; A_e absorbanta probei etalon; C_e concentratia etalonului.

Pentru doxepina intr-un flacon Erlenmayer de 50 ml se aduc 5 ml urina si 1,5 ml solutie saturata de permanganat de K . Se agita energic si dupa 5 minute se adauga 10 ml hexan. Se reagita 10 minute. Dupa centrifugare extractul hexanic este adus in cuva de cuart de 20 mm a spectrofotometrului si se citeste absorbanta la 266 nm si 295 nm, folsind ca solutie de referinta hexanul. Din valoarea absorbantei obtinuta la 266 nm se scade valoarea obtinuta la 295 nm. Paralel se lucreaza in mod identic, solutia etalon. Se calculeaza concentratia in mg/ 100 ml .

Pentru imipramina, intr-o palnie de separare de 50 ml se introduc, n1 ml de produs biologic (ser, plasma, urina, aspirat gastric, sau 5 ml sange total diluat cu 5ml apa), 4 ml sol NaOH 40% si N1 ml cloroform (de patru ori volumul probei luate in lucru). Se agita energic 5 minute se decanteaza, si apoi se centrifugheaza la 4000 tpm. Faza cloroformica spalata cu 10 ml apa distilata, se centrifugheaza din nou si se indeparteaza faza apoasa.

Intr-un flacon Erlenmayer de 25 ml sunt adusi in n2 extract cloroformic, si N2 ml reactiv fosfoceric. Se agita energic 5 minute se decanteaza, si apoi se centrifugheaza la 4000 tpm, timp de 10 minute, si se elimina faza cloroformica prin aspirat. Se citeste absorbanta fazei apoase acide, la 630 nm fata de reactivul fosfoceric, ca lichid de referinta, intr-un interval de 30 minute.

Paralel se lucreaza in conditii similare o proba etalon.

Calculul rezultatelor care se exprima in gram/1000 ml produs analizat se efectueaza cu ajutorul relatiei:

Imipramina, g ‰ = Ap/Ae x Ce unde,

Ap absorbanta probei de analizat; Ae absorbanta probei etalon; Ce concentratia etalonului.

Folosind coeficientul de extinctie molara a imipraminei se poate utiliza formula:

Conc. g ‰ = (N1xN2)/(n1xn2) x GM x Ap/Em unde,

GM- greutatea molara a produsului; Em coeficientul de extinctie molara.

Cromatografie de lichide de inalta presiune

Pentru amitriptilina, nortriptilina, imipramina si desipramina . Substantele sunt extrase, din plasma alcalinizata, cu amestec hexan. Intr-o eprubeta de centrifuga se pipeteaza, 2 ml plasma si 0,5 ml, solutie saturata de CaCO3 . Dupa omogenizarea amestecului, se adauga 5ml solvent de extractie. Se agita timp de 5 minute si apoi se centrifugheaza la 2000 tpm. 2 minute. Faza organica, superioara este evaporata la 600C sub curent de azot, iar reziduul de extractie, este redizolvat in 20 μl faza mobila. 10 μl din aceasta solutie sunt injectati in cromatograf. Ariile sau inaltimile peak-urilor obtinute se compara cu cele ale standardelor interne.

In cursul tratamentului cu dibenzocicloheptadiene, sunt intalnite valori intre 3-40 μg/l de sange. In intoxicatiile fatale concentratiile sanguine, depasesc 1mg/100 ml de sange.