Chiralitatea

Chiralitatea este intalnita in toate formele de viata. Cel mai frecvent, dintre doua molecule reciproc simetrice numai una dintre ele se afla intr-un organism viu.

Pana relativ recent, interesul pentru chimia chirala a fost in cea mai mare parte academic, desi izomerii optici se cunosc inca de la inceputul anilor 1800. Prin anii 1980, a existat o crestere brusca a interesului comercial pentru substantele chirale, in special pentru substantele medicamentoase chirale. Acest entuziasm a fost hranit de catre descoperirea ca activitatea fiziologica a izomerilor poate diferi radical, mai ales de catre mult cunoscutul caz al Talidomidei. Medicamentul a fost produs si vandut ca un amestec racemic al imidei acidului N-ftalilglutamic. S-a descoperit mult prea tarziu ca activitatea fiziologica dorita apartine numai izomerului R-(+) si ca enantiomerul S-(-) este teratogenic, provocand numeroase cazuri de malformatii fetale. Dezastrul talidomidei a evocat interesul producatorilor farmaceutici si al organismelor de reglementare. Activitatea de cercetare in domeniul stereochimiei a fost frenetica. Administratia Medicamentului si a Alimentelor din Statele Unite (FDA) a recomandat ca fiecare izomer al noilor medicamente sa fie testat individual, fortand companiile sa trimita posibilele probleme legate de amestecurile racemice. Cererea pentru medicamente pure din punct de vedere enantiomeric a crescut rapid si cu cativa ani in urma (1993), piata mondiala a medicamentelor pure din punct de vedere enantiomeric a depasit 35 milioane de dolari si din acest total, aproape doua treimi au fost medicamente cardiovasculare si antibiotice.

Necesitatea de a testa diferitii enantiomeri ai medicamentelor a evocat nevoia unor proceduri analitice pentru separarea si determinarea cantitativa a acestora.

Fig. 1 Tehnici de separare chirala:

galben - analitice; verde - analitice i preparative; violet - preparative

Principala problema a fazelor sta ionare chirale folosite la scara preparativa este dificultatea de a prezice ordinea elu iei i separarii anali ilor. De aceea, uneori este necesara o etapa suplimentara in developarea metodei pentru a cauta in bazele de date o faza sta ionara chirala potrivita. Aceast lucru nu se aplica i fazelor sta ionare chirale cu polimeri moleculari imprima i (PMI), caz in care se cunoa te dinainte ordinea de migrare. Fazele sta ionare cu polimeri moleculari imprima i au fost folosite in cromatografia de lichide, electroforeza capilara, cromatografia de fluide supercritice, cromatografia pe strat sub ire, extrac ia in faza solida precum i ca un instrument de determinare a excesului de enantiomeri. 

Fazele sta ionare chirale cu polimeri moleculari imprima i, fa a de fazele sta ionare tradi ionale, nu con in un tip de sit unic, ci o distribu ie de situri cu diferite grade de afinitate pentru enantiomerul  folosit ca ablon. Din cauza abunden ei scazute a siturilor cu energie mare, fazele sta ionare chirale cu polimeri moleculari imprima i func ioneaza in condi ii par ial saturate, ceea ce face ca picurile sa fie late i asimetrice cu coada. Eficien a i capacitatea de incarcare limitate, in plus nevoia prepararii  unei cantita i de enantiomer pur pentru prepararea unei arje de polimeri, sunt percepute ca fiind principalele neajunsuri ale acestor faze. In ciuda acestor dezavantaje, se pare ca a reinviat interesul pentru aceste faze sta ionare, care pot fi preparate reproductibil i la costuri reduse. Avantajele i dezavantajele acestor faze sunt prezentate in tabelul urmator:

Deoarece enantiomerii au proprieta i fizice identice, enantioselectivitatea polimerilor moleculari imprima i forma i din unita i monomerice achirale, poate fi datorata modificarilor structurale cauzate de ablonul chiral. De obicei, aceste modificari structurale sunt datorate siturilor sau cavita ilor imprimate, complementare ablonului in ceea ce prive te marimea, forma i pozi ionarea gruparilor func ionale. Conform unei interpretari mai generale, enantioselectivitatea poate fi rezultatul suprafe elor chirale induse de moleculele ablon in lan ul polimeric principal, datorita stereochimiei relative induse a centrilor chirali adiacenti sau a structurilor helicoidale existente in macromolecula.

Dovezile de azi sus in existen a unor situri de legare discrete cu complementaritate crescuta enantiomerului- ablon. Acestea se datoreaza enantiomerului- ablon care formeaza polimeri cu afinitate i selectivitate crescuta pentru acesta.

Fazele sta ionare chirale cu polimeri moleculari imprima i prezinta selectivitate pronun ata pentru enantiomerii ablon, fara a influen a analogii structurali. Amestecul racemic corespunzator enantiomerului ablon este bine separat pe fazele sta ionare cu polimeri moleculari imprima i corespunzatoare, in timp ce amestecurile racemice ale analogilor sunt mai pu in re inute sau foarte pu in separate. Abilitatea de a recunoa te diferen e structurale subtile au fost atribuite combinarii grupelor func ionale i complementarita ii formelor intre situl de legare i substrat.

Fig. 2 Posibilele origini ale enantioselectivitatii PMI

a. Situri de legare monomoleculare; b. Modelul ciorchine; c. Chiralitatea lantului principal

inand cont de unele proprieta i de legare ale unor polimeri moleculari imprima i, asemanatoare cu ale unor receptori, a fost propus ca ace ti polimeri sa fie folosi i ca o sita moleculara pentru a sorta moleculele pe baza activita ii biologice a acestora. S-a presupus ca moleculele de legare vor prezenta de asemenea afinitate crescuta pentru receptorul biologic corespunzator. Intr-un studiu, Hart i colab. au folosit enantiomerii benzodiazepinelor ca i abloane pentru a prepara receptori sintetici corespunzatori unei familii de receptori biologici, GABA, structurile carora sunt necunoscute. O serie de analogi de benzodiazepine au fost imprima i iar polimerii moleculari rezulta i au fost evalua i ca i faze sta ionare in cromatografie. Cu cat diferen ele structurale intre ablon i substrat cresc, enantioselectivitatea i reten ia scad de asemenea. De asemenea de notat este faptul ca o data cu cre terea marimii sau numarului de situri de interac iune, cre te i enantioselectivitatea.

Cei mai mul i polimeri moleculari imprima i sufera o distribu ie heterogena a siturilor de legare. In imprimarea necovalenta, in principal contribuie doua efecte la heterogenitatea sitului de legare. Din cauza naturii amorfe a polimerului, siturile de legare nu sunt identice, similar prepararii anticorpilor policlonali. Acest efect este intarit de complexarea nestoechiometrica monomer- ablon. In cele mai multe cazuri, cea mai mare parte a monomerului func ional exista intr-o forma libera sau dimerizata, fara a fi asociata cu ablonul. Ca o consecin a, doar o parte din ablonul adaugat amestecului de monomeri da na tere la situri de legare selective. Randamentul scazut al siturilor de legare apare din cauza dependen ei de selectivitate i alimentarea cu proba.

Reten ia i selectivitatea depind puternic de pH-ul fazei mobile. Selectivitatea este crescuta la pH scazut, insa scade cand pH-ul excede valoarea pK_a a solutului.

Primul pas in prepararea PMI consta din prearanjarea sablonului si monomerului in solvent. Sablonul trebuie sa contina in structura sa grupari capabile sa interactioneze cu monomerul cu suficienta putere pentru a forma un complex stabil prin intermediul legaturilor de hidrogen sau interactiunilor electrostatice.  Pana acum, cel mai folosit monomer a fost acidul metracrilic (MAA) impreuna cu acidul 2-(trifluormetil)acrilic si 2- sau 4-vinilpiridina (VP). Este important de subliniat ca, deoarece interactiunile sablon-monomer sunt guvernate de un proces de echilibru, se foloseste o cantitate mare de monomer pentru a deplasa echilibrul spre formarea complexului sablon-monomer. Oricum, excesul de monomer liber conduce la formarea de situri de legare nespecifice, cum sunt cele implicate in distributia heterogena a siturilor de legare observate in PMI.

Solventul utilizat in etapa de prepolimerizare este de asemenea foarte important, deoarece are o influenta directa asupra tariei interactiunilor sablon-monomer. In general, solventii cu o constanta dielectrica mica, cum sunt cloroformul si toluenul, ofera un mediu adecvat pentru stabilizarea legaturilor de hidrogen si/sau interactiunilor electrostatice intre monomer(i) si sablon. In afara de asta, solventul porogen joaca un rol important in morfologia polimerului cu diametrul porilor si suprafata specifice. In general, suprafata mica si porozitatea redusa conduc la o recunoastere mai dificila a sablonului din cauza difuziei scazute a analitului in siturile localizate in micropori.

In final, pentru a garanta stabilitatea complexului monomer-sablon in timpul polimerizarii si pentru a mari porozitatea polimerului, este necesar un grad de reticulare ridicat. Este important de mentionat ca prezenta agentului de reticulare conserva siturile de legare si influenteaza totodata si proprietatile fizice si chimice ale matricei polimerice. Din acest punct de vedere, etilenglicol-dimetacrilatul este agentul de reticulare cel mai utilizat in realizarea polimerilor pe baza de metacrilat, deoarece confera stabilitate termica si mecanica si un transfer de masa rapid.

Metodele de polimerizare utilizate in CEC

Polimerizarea in absenta unui solvent

Acest tip de polimerizare a fost de departe cea mai utilizata metoda pentru sinteza PMI. Aceasta metoda consta doar din polimerizarea amestecului de reactivi (sablon, monomeri functionali, agent de reticulare, initiator, porogen) ducand la formarea blocului polimeric. Apoi, acest bloc este sfaramat iar in final este trecut prin sita pentru a obtine particule de polimer de dimensiunile dorite pentru aplicatia dorita. Aceasta metoda de polimerizare este ideala din punct de vedere al simplicitatii obtinerii, insa dezavantajul major este obtinerea unor particule de dimensiuni si forme diferite.

Polimerizarea prin precipitare (dispersie)

Polimerizarea prin precipitare implica polimerizarea monomerilor in solutie diluata (<5% m/V), in solventi potriviti. In acest sistem diluat, lanturile de polimer, crescand, nu pot ocupa intreg volumul vasului, rezultand o dispersie de particule de micro-gel in solvent.

Particulele aproape sferice si monodispersate, pot fi obtinute prin aceasta metoda cu randamente bune, fiind posibila ajustarea marimii si porozitatii particulelor prin modificarea conditiilor de polimerizare. Prin aceasta metoda se pot obtine particule sferice cu diametru mai mic de 1 µm, insa prin diferite amestecuri de monomeri, agentii de reticulare si porogeni, pot rezulta particule cu dimetru mai mare (3-5 µm). Oricum, chiar si influenta sablonului poate influenta morfologia finala a particulelor de polimer, conducand chiar la formarea de aglomerate in loc de particule dispersate.

PMI - materiale compozite pe baza de silice

Aceasta metoda ofera cea mai directa cale de a obtine particule imprimate sferice, deoarece polimerizarea are loc prin grefarea filmelor de PMI pe suprafata sferelor preformate (ex.: silice). Aceasta tehnica consta in imobilizarea unui azo-initiator pe suprafata particulelor de silica pentru a genera radicalii initiatori pe suprafata suportului, rezultand filme de PMI omogene cu grosime variabila. Timpul de polimerizare trebuie sa fie strict controlat pentru a preveni polimerizarea in solutie. O alternativa pentru a depasi aceasta problema este folosirea asa numitor initiatori radicalici. Acestia se descompun pentru a da nastere la doi radicali diferiti, unul fiind capabil sa initieze polimerizarea, iar celalalt fiind stabil, dar capabil sa opreasca cresterea lanturilor de polimeri prin recombinare. Prin imobilizarea unui initiator radicalic pe suprafata de silice, polimerizarea are loc prin intermediul radicalului activ atasat pe suprafata de silice, in timp ce radicalul inactiv este prezent in solutie. Astfel, polimerizarea in solutie este evitata si cresterea lanturilor de polimer este controlata prin recombinarea radicalului inactiv prezent in solutie prin controlarea conditiilor de polimerizare.  

Polimeri monolitici

Aceasta procedura, introdusa de Matsui si colab. pentru aplicatiile HPLC, consta din umplerea unei coloane cu toti reactivii necesari imprimarii moleculare. Coloana este apoi incalzita, rezultand o bara continua de polimer poros. Alegerea solventului porogenic trebuie sa fie facuta astfel incat sa rezulte un polimer cu o porozitate suficienta pentru a asigura buna curgere prin acesta. In plus, porogenul folosit trebuie sa fie de polaritate scazuta pentru ca interactiunile sablon-monomer sa poata avea loc. In general, au fost obtinute separari bune, insa nu au fost observate imbunatatiri in forma picurilor, cel mai posibil din cauza controlului inexact al marimii porilor.

Suporti de separare in MIP-CEC

Suporti de separare pe baza de particule

Capilare umplute

Un mod foarte raspandit de a prepara coloanele capilare pentru CEC este umplerea capilarei de silice topita cu materialul dorit, ce joaca rol de faza stationara. Aceasta procedura poate fi de asemenea fi folosita pentru prepararea coloanelor capilare PMI ori de cate ori matricea polimerica poate avea suficienta sarcina pentru a sustine fluxul electroosmotic (EOF). In acest sens, folosirea monomerilor ionizabili si a agentilor de reticulare utilizati in tehnologia PMI poate produce suficient EOF pentru operarea acestora in sistemele de EC. Asta se intampla si cu MAA si EDMA, monomer si respectiv agent de reticulare, pe care se bazeaza si obtinerea PMI utilizati in CEC.  

Lin si colab. au preparat PMI ai anilidei L-fenilalaninei si L-fenilalaninei prin polimerizare fara solventi conventionala iar dupa faramitarea si cernerea polimerilor, au fost selectate particule < 10 µm si apoi introduse in capilare de silice topita. O parte a capilarei nu a fost umpluta cu material pentru ca detectia in coloana sa aiba loc.

Separarea D,L-fenilalaninei a fost realizata cu amandoua coloanele capilare cu PMI, rezolutia fiind mai  mare decat celei obtinute prin HPLC folosind aceleasi particule. Totusi, unul dintre principalele dezavantaje ale utilizarii capilarelor umplute este necesitatea folosirii fritelor de material silicat. Diferentele dintre taria EOF-ului generat in frita sau in zonele umplute ale capilarei devin clare. Ca o consecinta, apar largiri ale picurilor si se formeaza frecvent bule in interiorul capilarei, ducand la caderi ale curentului si pierderii EOF-ului.

O posibilitate de a minimaliza nepotrivirea dintre umplutura si compozitia fritei din coloanele capilare cu PMI este umplerea acestora cu particule composite de silica iar fritele sa fie create doar prin arderea fazei stationare. Deoarece compozitia fritei obtinute si a fazei stationare sunt similare, diferentele dintre tariile EOF-ului generat in frita sau in zonele umplute sunt minime.

Particulele de compozit au fost preparate prin grefarea filmelor de PMI ai anilidei L-fenilalaninei pe particule sferice de silica de diferite marimi si porozitati. Atat enantioselectivitatea cat si capacitatea de umplere a probei s-au dovedit a fi dependente de cantitatea de polimer grefat pe suprafata particulelor de silica.

Capilare fara frita

O alta abordare pentru a depasi problemele asociate cu folosirea fritelor in coloanele capilare umplute este fixarea fazei stationare de PMI de capilara de silice topita. Suprafata capilarei de silice topita se modifica cu trimetoxisililpropil metacrilat iar apoi are loc polimerizarea prin dispersie (precipitare) in-situ folosind MAA si EDMA ca si monomer, respectiv agent de reticulare. 

O alternativa a prepararii de coloane capilare umplute cu PMI fara frite, este imobilizarea polimerului prin captarea acestuia intr-o retea potrivita. Coloanele capilare cu PMI astfel imobilizate au fost preparate pentru prima data de Lin si colab., folosind un gel de acrilamida ca si mediu de imobilizare. Particulele de PMI (<10 µm) obtinute prin sfaramare si cernerea unui polimer obtinut prin tehnologia fara solvent au fost suspendate intr-un amestec de acrilamida si bisacrilamida. Suspensia a fost apoi introdusa intr-o capilara de silice topita si apoi incalzita la 40 sC pentru a produce formarea retelei de gel.

PMI de tip monolit

Desi coloanele monolitice pot fi incluse in grupul capilarelor umplute, acestea au anumite caracteristici si prezinta cateva avantaje care le plaseaza intr-o categorie diferita. Un monolit consta dintr-un polimer cilindric continuu, in interiorul unei capilare. Primul pas in prepararea coloanei monolitice este modificarea peretelui capilarei in vederea obtinerii unor grupe functionale pe suprafata peretelui ce vor participa in procesul de polimerizare. In acest fel, monolitii PMI raman fixati in capilara, fara a fi nevoie de frite de retinere. Deoarece nu exista particule individuale, performantele fazelor stationare cu PMI sunt guvernate in principal de densitatea si porozitatea polimerului rezultat. Prepararea coloanelor capilare cu PMI de tip monolit pentru diversi analiti printr-un proces de polimerizare foto-initiat a fost descrisa de catre Schweitz si colab.. Capilarele de silice topita au fost derivatizate cu [(metacriloxi)propil]trimetoxisilan in vederea producerii grupelor functionale pentru legaturile covalente al polimerului pe baza de metacrilat pe suprafata capilarei. In timpul polimerizarii initiate in UV, fereastra de detectie a fost acoperita cu folie de aluminiu pentru a preveni formarea polimerului in aceasta zona. S-a dovedit ca timpul de polimerizare a fost principala variabila ce a influentat porozitatea polimerului format. Aceeasi autori au raportat ca prin adaugarea in porogen de procente scazute de izooctan (1-25%) au rezultat monoliti "superporosi". Prin folosirea unei capilare cu PMI preparata prin aceasta metoda, a fost realizata separarea completa a enantiomerilor R si S ai propanololului in mai putin de 2 minute iar timpul de separare a fost mai tarziu redus la 30 s prin utilizarea de PMI de tip monolit scurt. Lin si colab. au utilizat pentru prepararea coloanelor de CEC cu PMI pe baza de MAA, o procedura de inducere a polimerizarii termice. Modificarea capilarei a fost realizata printr-un protocol complet diferit, bazat pe folosirea clorurii de tionil si a unui reactiv Grignard pentru a obtine o jumatate vinil pe suprafata capilarei de care polimerul se poate lega prin legaturi Si-C. In acest caz, monolitul obtinut a ocupat intreaga lungime a capilarei, atasandu-se apoi o a doua capilara continand fereastra de detectie. Enantiomerii fenilalaninei si analogii structurali ai acesteia au fost separati folosind aceasta metoda, insa eficienta separarii nu a fost atat de buna. Aceasta se poate datora cineticii de asociere/disociere lente a analitului cu polimerul, aceasta fiind o problema des intalnita in coloanele cu PMI pe baza de MAA. Separarea poate fi imbunatatita folosind un amestec de monomeri de MAA si 2-VP in loc de MAA singur. Includerea 2-VP confera un al doilea set de interactiuni (interactiuni ionice) intre analit si polimer, ceea ce duce in acest caz la o separare superioara.

O modalitate de a imbunatati separarile in coloanele capilare cu PMI de tip monolit este prin inlocuirea unei parti de monomer MAA cu alti monomeri ce interactioneaza mai slab (metil, butil sau epoxipropil metacrilat) cu o anumita. De asemenea, aditia in tamponul de lucru a modificatorilor organici si/sau anumitor surfactanti, ca de exemplu tween 20, s-a dovedit a imbunatati performantele coloanelor continand PMI.

Capilare acoperite

Alta abordare propusa spre a imbunatati separarea consta din prepararea capilarelor cilindrice deschise a caror suprafata interioara este acoperita cu un strat subtire de PMI. Folosirea unui film in locul unei coloane brute ca si faza stationara in CEC bazata pe PMI ofera o serie de avantaje, printre care prepararea relativ simpla a capilarei, regenerarea si schimbul de electrolit, eliminarea presiunii generate de materialul de umplere si minimalizarea problemelor asociate cu infundarea si/sau formarea bulelor in interiorul capilarei. Principalul dezavantaj este reducerea fazei stationare utilizate, ceea ce limiteaza cantitatea de proba aplicata si poate complica detectia in anumite aplicatii. Peliculele de acoperire MIP pot fi preparate prin activarea capilarelor cu 3-metacriloxipropiltrimetoxisilan si in continuare filmul de PMI al acidului S-(+)-fenilpropionic se sintetizeaza in interiorul capilarei folosind polimerizarea prin precipitare.

O alta posibiltate de sinteza a filmelor de PMI este prin modificarea intr-o prima etapa a peretelui capilarei cu 3-(trimetoxisilil)propilmetacrilat pentru a oferi puncte de ancorare polimerului. Apoi, capilara a fost umpluta cu amestecul de reactivi iar polimerizarea a fost initializata termic. Capilara a fost conectata la un sistem de vid pentru a elimina resturile de reactivi si pentru a forma un film de polimer in jurul capilarei. Eficienta separarii este superioara in CEC fata de cromatografia lichida in conditii similare.

Tehnica de polimerizare prin initierea suprafetei a fost de asemenea utilizata pentru prepararea invelisurilor de PMI pentru CEC. In acest scop, un initiator fotolabil [acidul 4,49-azobis-(4-cianopentanoic)] a fost imobilizat pe peretele capilarei inainte de a introduce amestecul de polimerizare.

Nanoparticulele ca si aditivi in CEC

Folosirea nanoparticulelor de PMI este probabil cea mai simpla cale de a realiza separari in CEC pe baza de PMI, din moment ce nu este necesara imobilizarea polimerului pe capilara. In acest caz, particulele de PMI sunt adaugate tamponului de lucru, actionand ca o faza pseudo-stationara in aceeasi maniera in care micelele se comporta in cromatografia electrocinetica micelara. Acest format permite folosirea unei noi "coloane de PMI" pentru fiecare analiza, ceea ce constituie un avantaj clar in optimizarea metodei. In plus, cantitatea de PMI introdusa in capilara poate fi cu usurinta controlata, eliminand complet problemele asociate cu ne-reproductibilitatea dintre diferite coloane capilare.  

S-a realizat astfel separarea enantiomerilor de propanolol fara obtinerea de picuri asimetrice cu coada, iar separarea obtinuta poate fi cu usurinta crescuta doar prin simpla crestere a cantitatii de PMI adaugate.

Pe de alta parte, continutul mai mare de 0,05% (m/V) in tamponul de lucru produce o incalzire Joule semnificativa si creste turbiditatea solutiei, ceea ce deranjeaza detectia.

O alternativa la problemele mentionate combina folosirea nanoparticulelor de PMI preparate prin polimerizare prin precipitare cu tehnica partiala de umplere. Intr-o prima etapa, capilara este conditionata si umpluta cu tampon de lucru la pH-ul la care particulele de PMI sunt incarcate negativ, iar analitii sunt prezenti ca si cationi. Apoi, este introdusa la capatul anodic o suspensie de particule de PMI in tamponul de lucru si un dop de proba. Odata cu aplicarea voltajului de separare, analitii migreaza la capatul catodic si trec printre particulele de polimer care migreaza la capatul anodic. Din moment ce atat proba cat si particulele sunt duse de catre EOF, acestea vor migra la capatul catodic cu viteze diferite. In acest fel, analitii ajung la detector inaintea dopului de PMI si interferenta particulelor de PMI este complet evitata.

Concentratia sablonului poate de asemenea sa influenteze atat selectivitatea cat si marimea nanoparticulelor de PMI obtinute.

Concluzii

Capacitatile PMI de recunoastere selectiva a unui analit dat fac din acestia materialele perfecte pentru a fi folosite ca si faze stationare in electrocromatografia chirala. Insa, cateva dezavantaje, in special legate de heterogenitatea siturilor de legare si transferul de masa scazut conduc la largirea si alungirea picurilor, prevenind folosirea lor la scara larga.

In Romania, nu s-a mai incercat enantioseparari folosind polimerii moleculari imprimati prin electrocromatografie capilara. Aceasta tehnica poate avea aplicatii in extractia si separarea unor substante din produse biologice sau vegetale, atat in scopuri analitice cat si preparative.