METODE IMUNOLOGICE DE UZ CURENT

Reactiile de aglutinare, hemaglutinare, hemaglutinoinhibare

Principiul reactiilor de aglutinare este formarea de legaturi incrucisate intre imunoglobulinele G ( IgG) bivalente sau imunoglobulinele M ( IgM) pentavalente si antigenele cu multipli determinanti antigenici ( epitopi). Aceasta face ca o molecula de imunoglobulina sa reactioneze cu determinantii antigenici mai multor celule sau de pe suprafata mai multor particule , producand agregarea (aglutinarea) si eventual sedimentarea acestora.

Reactiile sunt foarte sensibile si specifice.

Excesul de antigene nu inhiba reactia, spre deosebire de excesul de anticorpi, care poate produce fenomenul de pro-zona.

Aglutinarea directa este cea in care celulele sau particulele sunt aglutinate direct de anticorpi. Hematiile, bacteriile, fungii si alte microorganisme pot fi aglutinate direct de anticorpii specifici.

Testele de aglutinare directa pot fi efectuate atit pentru detectia unor antigene pe suprfata celulelor; de exemplu antigenele de grup ABO sau Rh, fie pentru detectia anticorpilor in ser exemplu: prezenta hemaglutininelor la rece; prezenta anticorpilor anti-neutrofile

Aglutinarea indirecta ( pasiva) se refera la aglutinarea unor antigene adsorbite artificial pe suprafata unor celule (hematii) sau particule insolubile ( latex, carbon)

Reactiile de aglutinare indirecta sunt folosite:

-fie pentru detectarea anticorpilor in probe de ser, folosind antigenele corespunzatoare de pe suprafata unor celule sau adsorbite pe suprafata unor celule sau particule . Exemple : reactii de latex-aglutinare pentru: ASLO ( anti-treptolizina O), F.R. (factor reaumatoid), ANA, SLE (anticorpi antinucleari); RPR-carbon pentru anticorpii anti-cardiolipinici.

Fig. VII.1.   Schema reactiei de aglutinare indirecta RPR-carbon

fie pentru detectarea unor antigene solubile, folosind anticorpii corespunzatori fixati pe suprafata unei celule sau particule ( revers-aglutinare): Exemplu: prin metoda latex -aglutinarii, se poate determina simultan: Coagulaza legata sau "clumping factor", Proteina a, si polizaharidele capsulare ale S.aureus. Reactivul latex contine particule de latex sensibilizate cu anticorpi monoclonali specifici anticapsulari, fibrinogen si IgG .

Fig. VII.2. Reactia de revers aglutinare: latex-aglutinare

I: Schema; II: Rezultat pozitiv(A) , negativ(B)

Atunci cand antigenele sunt adsorbite pe suprafata hematiilor, reactia se numeste hemaglutinare.

Fig. VII.3. Schema reactiei de hemaglutinare

O alta categorie de reactii de hemaglutinare se refera la aglutinarea hematiilor sub actiunea unor virusuri ( virusuri hemaglutinante) Reactia poate fi folosita la detectarea si cuantificarea virusurilor dintr-o proba.

Prezenta anticorpilor antivirali in ser determina inhibitia hemaglutinarii. Reactia de hemaglutinoinhibare este folosita pentru diagnosticul indirect al unor infectii virale si pentru masurarea titrului anticorpilor antivirali.

Hemaglutinarea directa: testul Coombs direct ( TCD)

In tuburi sau in placa cu godeuri se realizeaza dilutii seriate , in ser fiziologic, ale unui ser ( imun antieritrocitar): ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32, . etc. Se adauga un ser control pozitiv si un ser control negativ.

In fiecare tub sau godeu se adauga suspensia de hematii, astfel incat concentratia finala de celule sa fie de aproximativ 1%.

Se agita usor si se lasa apoi nemiscate, la temperatura camerei, 1-2 h

Reactia pozitiva apare sub forma unei pelicule despuse uniform pe fundul tubului sau al godeului

Reactia negativa apare sub forma unui buton de hematii depus pe fundul tubului sau al godeului.

Pentru ca reactia sa fie interpretabila, se citesc martorii pozitivi si negativi, care trebuie sa fie ca atare.

Titrul este dat de ultima dilutie de ser care a determinat o reactie pozitiva, fiind egal cu inversul acesteia.

Semnificatia diagnostica a TCD:

- AHAI idiopatica cu Ac la cald, inclusiv AHAI medicamentoasa

- AHAI cu Ac la rece

- Transfuzia de sange incompatibil

- Alte cauze de AH: hepatite virale, pneumonia virala, mononucleoza infectioasa, meningita, LES si alte boli autoimune, tumori ( chist ovarian)

Cauze de eroare:

Reactivul antiglobulina umana necorespunzator si conservat necorespunzator, Sange coagulat si conservat la frigider in prezenta cheagului

Hiperproteinemie ( mielom)

Nerespectarea optimului termic al reactiei

Testele pentru detectia anticorpilor aglutinanti in ser se fac prin punerea in contact a unor dilutii binare de ser cu cantitati egale de antigen. Reactiile au loc in tuburi mici , in cantitati de 0.2 - 0.5 ml din fiecare reactant. Dupa cateva ore de incubare, aglutinarea este completa si tuburile sunt examinate, cu ochiul liber sau cu lupa pentru observarea aglutinatelor. Exista si varianta aglutinarii pe lama sau placa cu godeuri.

R. de hemaglutinare pasiva (indirecta ):

Exemplu: TPHA (Treponema pallidum haemagglutination)

TPHA este o reactie de hemaglutinare indirecta folosita pentru depistarea anticorpilor indreptati impotriva antigenelor specifice ale treponemelor patogene.

Principiu:

Hematii aviare pe suprafata carora au fost adsorbite antigene de Treponema pallidum ( susa Nichols) sunt suspendate intr-un diluent care impiedica aglutinarea nespecifica.

Hematiile astfel sensibilizate, puse in contact cu serul unui pacient ce poseda anticorpii corespunzatori, vor aglutina. Reactia poate fi efectuata calitativ sau cantitativ.

Tehnica imunoenzimatica ELISA

Principiu

Metoda ELISA presupune adsorbtia unuia dintre componentii imuni Ag sau Ac pe un suport solid. Imunoadsorbtia permite fixarea ulterioara a reactantilor din faza lichida, care urmeaza sa fie identificati ( tehnici calitative ) sau dozati ( tehnici cantitative).

Etapa finala este o reactie enzimatica, relevata printr-o modificare de culoare. Citirea se face spectrofotometric, iare interpretarea se face in functie de valoarea adsorbantei (intensitatea culorii), martorii +, - si valoarea de prag.

METODE

a)         metoda ELISA indirecta

b)   metoda ELISA COMPETITIVA

c)         metoda ELISA de tip sandwich

Exemple

DOZAREA ANTICORPILOR

a)      Metoda ELISA INDIRECTA - timpi:

Imobilizarea pe suportul solid a antigenelor specifice anticorpilor de dozat

Aditia probei de ser.

Incubare. Anticorpii care recunosc antigenele se fixeaza de acestia si raman atasati

3-5 spalari succesive, pentru a indeparta Ac nefixati (necorespunzatori Ag)

adaugarea conjugatului: Ac anti-imunoglobuline umane cuplati cu o enzima (peroxidaza)

incubare

3-5 spalari succesive

adaugarea substratului enzimei

incubare. Probele pozitive se coloreaza, intensitatea reactiei fiind direct proportionala cu cantitatea de ac din proba de ser

stoparea reactiei si citirea

b) Metoda ELISA COMPETITIVA

Faza solida este identica

Proba de ser nediluata se adauga concomitent cu conjugatul

Prezenta anticorpilor in proba blocheaza fixarea conjugatului.

Adaugarea substratului enzimatic si reactia de culoare.

Interpretare: intensitatea culorii este invers proportionala cu cantitatea de anticorpi din proba.

c) metoda ELISA de tip sandwich

Se bazeaza pe faptul ca Ac sunt del putin bivalenti

La faza solida se adsorb antigenele, de care se vor lega Ac din proba. Conjugatul - Ac-enzima , ocupa valentele libere ale Ac din proba ( Ac de dozat intre 2 straturi de Ag)