Diagnosticul de laborator in infectia HIV

1. Dinamica producerii markerilor virali

S-au imaginat diverse teste care pun in evidenta anumite componente virale specifice, numite si markeri virali - Figura 21 si 22.

1. Antigenul p24

· se gaseste in serul persoanei infectate

· detectabil in infectiile recente, inainte de aparitia anticorpilor

· dispar dupa aparitia anticorpilor anti-p24

· reapar in stadiile tardive de boala (SIDA), semnaland o replicare virala intensa si un

prognostic grav.

2. Anticorpii anti p24

· apar la 3-12 saptamani de la infectie - seroconversia. Perioada de la infectie pana la aparitia lor se numeste "fereastra imunologica".

3. Anticorpii anti gp120

· nu au rol protector

· sunt folositi ca marker de diagnostic.

Figura 21 - Dinamica producerii markerilor virali

Figura 22 - Dinamica markerilor de diagnostic la adulti si la copii

1.2. Diagnostic pozitiv. Metode de diagnostic

Standard detectarea anticorpilor anti-HIV: teste de tip ELISA (2 probe), cu confirmare prin Western-Blot. Aceasta combinatie de teste are o sensibilitate si o specificitate  peste 99,9%.

Testul Elisa prescurtare dupa termenul Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay : reactie imunoenzimatica), este o metoda indirecta, ce are o sensibilitate de 99-99,5%. A fost dezvoltat incepand cu anul 1985 si pune in evidenta prezenta anticorpilor anti-HIV, produsi de limfocitele B ale persoanei infectate. Au fost produse 4 generatii de teste Elisa, ultimele 2 fiind utilizate in prezent:

generatia I: se foloseste lizatul total viral de pe culturi de limfocite ("whole virus"), evidentiaza doar anticorpii anti-HIV de tip IgG

generatia II: se folosesc antigene clonale, evidentiaza doar anticorpii anti-HIV de tip IgG

generatia III: se folosesc antigene recombinate, evidentiaza anticorpi de tip IgM si Ig G.

generatia IV: metode combinate, introduse in 1997, care testeaza simultan prezenta anticorpilor tip IgM si IgG anti HIV si a antigenului p24. - Figura 23

Rezultate false:

1. fals negative - in fereastra imunologica - in primele 3-12 saptamani, pana la aparitia in circulatie a anticorpilor P24. Mai pot apare in caz de transplant medular, neoplazii, disfunctie limfocitara de tip B.

2. fals pozitive - probe de sange alterate, greseli de recoltare, probe contaminate, prezenta in sange a unor substante asemanatoare ca structura cu anticorpii (de exemplu, alcoolul sau unele droguri). De asemenea pot apare datorita reactiilor nespecifice cu alte proteine - la marile multipare, la politransfuzati, in boli hepatice, hemopatii maligne, transplant renal, boli autoimune, insuficienta renala cronica, infectii acute cu virusuri ADN.

Un test Elisa pozitiv se raporteaza ca test reactiv si impune efectuarea celui de al doilea test Elisa, din alta proba de sange, intr-un centru de referinta.

Dupa retestare, probele reactive trebuie confirmate prin metoda Western-blot.

Figura 23 - Interpretarea testului Elisa la 3 pacienti

Testul Western Blot sau IFA (prescurtare dupa termenul Immuno-Fluorescence Assay - reactie imunofluorescenta) detecteaza proteine specifice virale:

- glicoproteine de invelis ("env"): gp41, gp120, gp160

- proteine nucleare ("gag"): p18, p24/25, p55

- endonucleaze-polimeraze( "pol"): p34, p40, p52, p68

Este un test indirect ce pune in evidenta prezenta anticorpilor specifici fata de aceste proteine virale.

Daca si rezultatul testului Western Blot este pozitiv se declara seropozitivitatea HIV.

Criteriile CDC recomanda cel putin 2 din urmatoarele benzi: p24, gp41 sau gp160/120 pentru un test pozitiv sau nici una pentru un test negativ si prezenta oricarei alteia pentru un rezultat indeterminat (Figura 24)

Figura 24 - Interpretarea testului Western Blot la 3 pacienti

Alte teste utilizate:

1. Detectarea antigenului p24 - utilizat pentru diagnosticul infectiei in primele 2 luni, in faza premergatoare seroconversiei, utilizeaza o tehnica de imunocaptura. Este utilizat mai ales in SUA in testarea sangelui recoltat pentru donare, alaturi de testul Elisa. Mai este utilizat in caz de suspiciune de primo-infectie HIV si pentru identificarea copiilor cu infectie HIV, cu risc de a dezvolta disfunctie imuna severa.

2.Testul PCR Polymerase Chain Reaction) - utilizat pentru diagnosticul precoce si pentru monitorizarea tratamentului antiretroviral. Este un test de amplificare genica, depistand ADN-ul proviral din limfocite sau ARN-ul viral. Poate fi utilizat la 10-15 zile dupa expunere. Testul a intrat in 2004 pe piata si este folosit in special pentru depistarea virusului HIV din conservele de sange.

O varianta a acestui test, Real Time PCR (RT-PCR), poate detemina chiar si copiile genomului HIV din sange, permitand, astfel, aprecierea indirecta a concentratiei virale. Metoda se poate utiliza pentru noii nascuti si este cea care permite determinarea transmiterii directe mama-fat a virusului HIV imediat dupa nastere. Procedeul de testare a anticorpilor prezenti la noi-nascuti este fara valoare, pentru ca anticorpii IgG materni pot patrunde transplacentar in circulatia sangvina fetala. Inaintea aparitiei acestei metode pe piata se putea confirma sau exclude infectarea nou-nascutului abia dupa 15 luni, aceasta metoda reduce perioada de incertitudine la doar 4 luni.

3.Cultura virusului - metoda scumpa, rezervata pentru cazuri speciale, se face in laboratoare specializate, pe culturi de limfocite mononuclare umane stimulate cu fitohemaglutinina, in prezenta interleukinelor, apare un efect citopatogen in 2-3 saptamani.

4.Testele rapide OraQuick, OraSure, Clearview, Uni-Gold, Reveal, etc. - Figura 25 A si B, PLANSA 4

Sunt teste calitative, cu specificitate mare (99,8%), rezultatul este disponibil in 10-30 minute. Se pot efectua din sange, ser, plasma, saliva, transudat din mucoasa jugala sau gingivala. Exista si teste rapide pentru urina (Calypte). Un test rapid negativ nu exclude infectia HIV. Un test rapid pozitiv necesita confirmare Elisa si Western Blot.

Figura 25 - A si B - Testul OraQuick - Prezentare si modul de utilizare

5.Testele de a patra generatie

Some of the most modern HIV tests combine P24 antigen tests with standard antibody tests to reduce the 'diagnostic window'.Unele dintre cele mai moderne teste HIV combina testarea antigenului P24 cu teste standard de anticorpi pentru a reduce 'fereastra de diagnostic'. Testing for antibodies and P24 antigen simultaneously has the advantage of enabling earlier and more accurate HIV detection. Testarea pentru anticorpi si antigen P24 are loc in acelasi timp, avand avantajul de a permite mai devreme si mai precis detectarea HIV.

In the UK, fourth generation tests are the primary recommendation for HIV testing among individuals, but are not offered by all testing sites. ¹ During January 2010, Abbott submitted the first application for FDA-approval of a fourth generation test in the United States. ² In Marea Britanie, a patra generatie de teste este recomandarea primara pentru testarea HIV, dar nu sunt oferite de catre toate site-urile de testare in 2010. In timpul lunii ianuarie 2010, firma Abbott a depus prima cerere de aprobare de catre FDA a unui test de a patra generatie in Statele Unite.

Surse: 9,11,17,48,49,54,57,61,81,102,110,111,117,131,139.

1.3. Diagnosticul infectiei HIV-1 la copil

Se face in functie de varsta copilului:

Copil > 18 luni - teste ELISA

Copil < 18 luni - PCR ADN- HIV, PCR ARN- HIV la 0, 1, 3, 6 luni (Sb > 99% la 3 - 6 luni

- copil neinfectat - 2 determinari negative

- dupa varsta de 1 luna, in absenta ARV

- culturi virale

.Seroreverter ( SR ) :

- copil nascut din mama cu infectie HIV cu 2 teste ELISA negative (la un interval de > 6 luni) sau 1 test la > 18 luni si care nu are semne indicatoare de boala.

.Expus perinatal infectiei HIV ( E ):

copil < 18 luni seropozitiv prin teste ELISA

copil din mama cu infectie HIV la care nu s-a efectuat testarea.

Efectuarea testelor ARN-HIV la copil :

* in primele 2 zile de viata

* in ziua a 14-a, daca prima testare a fost negativa

* intre prima si a doua luna de viata

* intre a treia si a sasea luna de viata