 |  |
|
Se estimeaza ca exista peste 400 de virusuri distincte care infecteaza omul, iar spectrul manifestarilor clinice, epidemiologice si patogenice care rezulta in urma infectiilor virale este foarte vast.
Virusurile sunt unice in cadrul agentilor infectiosi. Caracteristicile majore care le diferentiaza de celelalte microorganisme sunt:
dimensiunea redusa (20-300 nm) care le permite sa traverseze filtrele bacteriologice pastrandu-si infectiozitatea
genomul viral poseda un singur tip de acid nucleic, fie ADN (dezoxiribovirusuri), fie ARN (ribovirusuri)
sunt total dependente de celula vie, fie eucariota, fie procariota, pentru replicare si existenta
nu poseda ribozomi sau aparat propriu de sinteza a proteinelor, mitocondrii sau sursa proprie de energie, deci sunt metabolic inerte in afara celulei gazda
desi unele virusuri poseda enzime propri ca, de pilda, ARN sau ADN polimeraza, ele nu pot amplifica si reproduce informatia in propriul genom in absenta celulei gazda.
Virionul (corpusculul elementar sau viral) reprezinta unitatea virala infectioasa intacta, inerta in afara celulei gazda.
Virusurile pot parazita celule umane, vegetale, bacteriene, fungice, parazitare si ale insectelor.
Unitatea de masura a dimensiunii virale o reprezinta nanometrul (1nm=10-9 m).
Virusurile cu importanta clinica au dimensiuni cuprinse intre 20-30 nm (picornavirusuri) pana la 300 nm (poxvirusuri). Ele sunt vizibile numai prin microscopie electronica. In contrast, bacteriile au aproximativ 1000 nm iar eritrocitele 7500 nm in diametru.
Metodele de masurare a dimensiunii virionilor sunt:
ultrafiltrarea care este o filtrare prin membrane de colodiu cu pori de marime cunoscuta,
observarea la ME in comparatie cu particule de referinta, de dimensiuni standard (particule de latex),
ultracentrifugarea datorita corelatiei intre rata de sedimentare si dimensiunea virionilor.
Prin examinare la ME, virionii prezinta o diversitate de forme: sferica (v.gripale, v.paragripele, adenovirusurile), paralelipipedica (poxvirusurile), de cartus (v.rabic), de bastonas (v.mozaicului tutunului, fagii filamentosi), de spermatozoid (bacteriofagii) etc.
Cunoasterea structurii virusurilor reprezinta o etapa importanta in identificarea acestora.
Structura de baza, obligatorie, a virionului o reprezinta nucleocapsida constituita dintr-un miez (core) de acid nucleic = genomul viral, protejat (inconjurat) de un invelis proteic numit capsida.
Virusurile formate numai din nucleocapsida se numesc virusuri neinvelite sau neanvelopate (nude).
Virusurile care prezinta pe langa nucleocapsida si un invelis extern lipoproteic, derivat din membrana citoplasmatica a celulei gazda, peplos sau anvelopa se numesc virusuri invelite (anvelopate).
a) Genomul viral este constituit dintr-un singur tip de acid nucleic, fie ADN fie ARN (niciodata ambii acizi nucleici !) care contine intreaga informatie genetica necesara replicarii virusului si care reprezinta suportul infectiozitatii virusului.
Molecula acidului nucleic (indiferent daca este ADN sau ARN) poate fi simplu spiralata (ss) sau dublu spiralata (ds), liniara sau circulara, continua sau segmentata.
Acidul nucleic al tuturor virusurilor ADN, cu exceptia parvovirusurilor, este ds (hepadnavirusurile au ADN partial ds cand nu sunt in timpul replicarii).
Acidul nucleic al tuturor virusurilor ARN, cu exceptia reovirusurilor, este ss.
In cazul virusurilor ARNss, genomul contine acid nucleic care poate fi cu polaritate pozitiva (+), caz in care poate actiona direct ca ARNm (mesager) in interiorul celulei infectate, sau poate fi cu polaritate (-), caz in care trebuie transcris de o enzima asociata virusului, ARN-transcriptaza, intr-un ARN cu polaritate (+) = "imaginea in oglinda".
Marimea genomului viral se coreleaza cu marimea capsidei sau anvelopei. Astfel
virusurile mari au un genom de dimensiuni mari care contine cateva sute de gene si codifica un numar relativ mare de proteine (poxvirusurile, herpesvirusurile, etc)
virusurile mici au un genom de dimensiuni reduse care contine doar 3 sau 4 gene si codifica un numar mic de proteine.
b) Capsida virala este un invelis format din numeroase unitati proteice numite capsomere.
Aceste capsomere sunt, de obicei, proteine de dimensiuni mici care se autoasambleaza in structuri capsomerice mari iar in final se asambleaza sub forma capsidei virale.
Capsomerele individuale pot fi puse in evidenta prin microscopie electronica. Fiecare capsomer trebuie sa posede o anumita structura chimica ce ii permite sa se asambleze cu capsomere asemanatoare pentru a forma o structura complexa cum este capsida.
Cea mai simpla structura care poate fi construita in acasta maniera este simetrica si include 2 tipuri de simetrie a capsidelor:
*helicoidala (helicala), cu aspect tubular
*icosaedrica, cu aspect sferic.
Tipurile nesimetrice de capside sunt reprezentate de:
*capside cu simetrie binara (icosaedrica-helicala)
*virusurile cu organizare complexa
Functiile capsidei:
1. asigura forma caracteristica virionului
2. protejeaza acidul nucleic viral
3. la virusurile neinvelite, fixeaza virionul de receptorii specifici de pe celula gazda.
c) Peplosul sau anvelopa reprezinta o membrana cu structura similara membranei citoplasmatice a celulei gazda. Aceasta membrana contine lipide, proteine si lipoproteine.
Pe suprafata acestei membrane se gasesc formatiuni specifice virale, codificate de virus:
1. spiculi ("peplomere") de natura glicoproteica. Au functia de adsorbtie si penetrare in celula gazda.
Exemple:
*hemaglutinina (HA) = rol in atasarea virusurilor la celula gazda ; confera virusurilor proprietatea de a liza hematiile diverselor specii animale
*neuraminidaza (N) = faciliteaza paarunderea virusurilor in celula
2. factori de fuziune. Se gasesc sub forma inactiva (FO) iar sub actiunea proteazelor celulei gazda se scindeaza generand forme active (F1,F2). Au functia de initiere a infectiei.
3. proteina M (matrix) captuseste fata interna a anvelopei (frecvent la virusurile ARN cu polaritate negativa).
La unele virusuri, faciliteaza asamblarea, iar la altele, asigura mentinerea formei (exemplu: rhabdovirusuri)
Functiile invelisului:
a) asigura atasarea virusurilor anvelopate (invelite) la celula gazda
b) de protectie - Rolul protector al invelisului viral este anihilat de tratamentul cu solventi lipidici (eter, cloroform, saruri biliare), rezultand inactivarea particulei virale. Permite clasificarea virusurilor in:
-eter-sensibile = virusurile invelite
-eter-rezistente = virusurile neinvelite
Proteine functionale-enzime
Numarul de gene care constituie genomul unor virusuri este redus, de aceea sinteza proteinelor enzime codificate de virus este limitata. Sinteza lor este importanta pentru replicarea genomului viral.
Exemple:
1. replicaze sau transcriptaze virale = ARN-polimeraze ARN-dependente prezente la virusurile ARN cu polaritate negativa (-).
2. reverstranscriptaza (ADN-polimeraza ADN-dependenta) sau integraza, prezenta la retrovirusuri .
Taxonomia virala actuala desparte ribovirusurile (genom ARN) de dezoxiribovirusuri (genom ADN). In aceste diviziuni, virusurile se grupeaza (de la simplu la complex) in tulpini, specii, genuri, subfamilii si familii, dupa criteriul inrudirii in secventa nucleotidelor din genom.
Familia este desemnata cu sufixul VIRIDAE. Apartenenta la o familie presupune o origine comuna si caractere comune care nu se intalnesc la alte grupuri de virusuri.
Subfamilia este denumita cu sufixul VIRINAE.
Genul este denumit cu sufixul VIRUS si este constituit din specii care au in comun caracterele familiei dar au si particularitati proprii care le diferentiaza de alte grupuri de virusuri ce apartin aceleiasi familiii.
Specia se exprima fara sufix, denumirii de 'virus' adaugandu-se numele intreg. Este definita ca fiind grupuri de tulpini virale care se deosebesc intre ele prin prezenta unor gene ce codifica aceste deosebiri dar au asemanari genomice si antigenice.
Criterii taxonomice
1. Proprietatile virionului: dimensiuni, forma, prezenta peplosului
2. Proprietatile genomului: tipul de acid nucleic (ADN sau ARN), numarul de spire (simplu sau dublu spiralat = s.s / d.s), liniar sau circular (L / C), sensul de transcriere sau polaritatea (pozitiva, negativa sau ambele = ambisens), dimensiunea genomului.
3. Replicarea virala: strategia replicarii, transcriptie, translatie, modificari posttranslationale, asamblarea si eliberarea virionilor progeni.
4. Proprietatile proteinelor virale: numar, secventa de aminoacizi, greutate moleculara, functie (transcriptaze, reverstranscriptaze, hemaglutinine, neuraminidaze )
5. Proprietati fizico-chimice: stabilitate termica, rezistenta la pH, radiatii, detergenti, solventi.
6. Proprietati biologice: spectrul gazdelor naturale ( bacterii, plante, animale vertebrate sau nevertebrate) si experimentale, tropism celular, transmisie prin vector, relatii serologice.
Virusurile prezinta un inalt grad de parazitism intracelular si sunt inerte metabolic pana cand infecteaza o celula susceptibila. In celula gazda, virusurile se replica redirectionand mecanismele biochimice ale celulei spre formarea de componente pentru noi particule virale.
Genomul viral
Virusurile mari au, de obicei, acid nucleic cu greutate moleculara crescuta si care are capacitatea de a codifica un numar mare de proteine; de aceea, aceste virusuri codifica un numar mare de enzime implicate in replicarea lor.
Virusurile mici au un acid nucleic cu greutate moleculara scazuta si un potential de codificare limitat, de accea codifica doar unele din proteinele lor structurale si utilizeaza cel putin cateva enzime ale celulei gazda, pentru propria replicare.
Replicarea virusurilor parcurge urmatoarele secvente:
1. recunoasterea celulei gazda
2. adsorbtia (atasarea ) virusului de celula gazda
3. penetrarea (patrunderea) virusului in celula gazda
4. decapsidarea virusului
5. sinteza macromoleculara
a) biosinteza ARNm precoce si a proteinelor precoce = proteine-enzime
b) replicarea genomului viral
c) biosinteza ARNm tardiv si a proteinelor tardive = proteine structurale
6. eliberarea virionilor progeni din celula gazda
1.Recunoasterea celulei gazda
Pentru a infecta o celula, virusul trebuie, in primul rand, sa recunoasca celula care ii permite replicarea. Acest proces este realizat datorita existentei unor situsuri receptor-specifice (de natura proteica) situate pe suprafata externa a particulei virale. Aceste situsuri reactioneaza specific cu receptori corespunzatori (de natura glicoproteica sau glicolipidica) de pe suprafata celulelor 'tinta'. Astfel, prin aceasta interactiune precisa de tip 'cheie-broasca' se explica faptul ca anumite virusuri prezinta tropism pentru anumite gazde si pentru anumite tesuturi ale gazdei respective.
2.Atasarea virusului de celula gazda
Atasarea virusurilor este specifica si implica legarea situsurilor receptor-specifice de receptorii specifici aflati pe membrana citoplasmatica a celulei gazda.
a) Structurile de atasare ale virusului pot fi:
*capsomerele capsidei, prezente la virusurile neanvelopate
*glicoproteinele, ce reprezinta proiectii ale invelisului viral, la virusurile anvelopate.
b) Receptorii specifici de pe membrana citoplasmatica a celulei gazda sunt constituenti normali ai acesteia.
Exemple de proteine virale de atasare = tabel pag. 450 - Murray
Multiplele interactiuni dintre proteinele virale de atasare si receptorii celulei gazda, ataseaza ferm virusul de celula gazda. Aceste interactiuni pot reprezenta mecanismul "tragaci" (declansator) in urma caruia este eliberata nucleocapsida in celula gazda.
3. Penetrarea sau patrunderea virusului in celula gazda (internalizarea)
Dupa atasarea la celula gazda, virusul trebuie sa penetreze membrana celulara externa si sa elibereze genomul viral in mediul intracelular, pentru replicare. Penetrarea se poate realiza prin 3 mecanisme, in functie de structura virusului:
fuziunea invelisului viral la membrana celulara externa, cu eliberarea ulterioara a acidului nucleic viral,
viropexia (pinocitoza) - internalizarea intregului virion si fuziunea ulterioara cu o membrana interna vacuolara, pentru eliberarea acidului nucleic viral
penetrarea directa - virusurile lipsite de membrana lipidica par sa treaca direct prin membrana citoplasmatica externa.
Fuziunea este mecanismul de internalizare folosit de paramyxovirusuri (v. rujeolic) (Fig. 2. 3. - L. Collier, J. Oxford, pag. 21). Aceste virusuri poseda o 'proteina de fuziune' ce mediaza fuziunea intre lipidele virale si ale membranei celulei gazda.
Viropexia (Fig. 2.3. - L. Collier, J. Oxford, pag. 21) se bazeaza pe existenta la nivelul membranei celulelor de mamifere a unei proteine (clathrina) care este implicata si in patrunderea unor molecule esentiale (substante nutritive, hormoni) in celule.
4. Decapsidarea si migrarea acidului nucleic la locul replicarii
Decapsidarea consta in indepartarea sau distrugerea capsidei virale astfel incat genomul viral sa devina accesibil mecanismelor de transcriptie si translatie. In multe cazuri, penetrarea si decapsidarea se produc sub forma unui proces unic. Astfel, in cursul traversarii membranei citoplasmatice, unele virusuri sufera alterari la nivelul structurii capsidei, aceste alterari facilitand intrarea acidului nucleic in citoplasma.
In cazul virusurilor lipsite de anvelopa, se poate produce fuziunea cu lizozomi, astfel incat decapsidarea se realizeaza prin enzimele lizozomale.
5. Sinteza macromoleculara. Biosinteza componentilor virali
6. Eliberarea virusului din celula gazda
In urma proceselor descrise mai sus, se realizeaza maturarea si se pun premizele eliberarii noii particule virale din celula gazda. Aceasta din urma etapa se poate realiza prin doua mecanisme : eliberarea prin inmugurire si eliberarea prin liza celulara.
In cazul virusurilor eliberate prin inmugurire, o parte din proteinele virale sunt transportate la nivelul membranei celulare externe a celulei gazda, iar alte proteine structurale virale se cantoneaza la nivelul membranei celulare interne. Proteinele si acidul nucleic se asambleaza si proemina prin membrana celulara. Aceasta proeminenta ('mugure') este apoi desprinsa si un nou virion este eliberat. Adesea, in cazul virusurilor eliberate prin inmugurire, procesul descris mai sus se repeta succesiv, astfel incat o celula gazda elibereaza valuri succesive de noi particule virale.
Eliberarea prin liza celulara presupune asamblarea completa a virionului in citoplasma celulei gazda si eliberarea sa prin liza si moartea celulei respective.
Interactiunile intre virus si celula gazda sunt de o deosebita importanta, in sensul ca ele pot influenta 3 aspecte esentiale :
- producerea infectiei
- tipul de infectie
- efectul final (deznodamantul) asupra gazdei.
A. Factorul viral - patogenitate, virulenta
Termenul de patogenitate se refera la gradul de severitate al bolii cauzate de un microorganism in comparatie cu cele cauzate de alte microorganisme (de ex. patogenitatea virusului rabic este mai mare decat cea a virusului rujeolic).
Termenul de virulenta se refera la gradul de severitate al bolii cauzate de o tulpina in comparatie cu alte tulpini ale aceluiasi microorganism. Adesea virulenta sau absenta acesteia la un microorganism pot fi dependente de portini extrem de reduse ale genomului. Altfel spus, o atenuare a virulentei se poate obtine in unele cazuri printr-o mutatie punctiforma. Aceste aspecte sunt de mare importanta pentru prepararea vaccinurilor specifice precum si din punct de vedere epidemiologic si terapeutic.
Un alt factor viral important il constituie doza infectanta care uneori joaca un rol important, in sensul ca o concentratie ridicata de virus poate determina o imbolnavire chiar atunci cand virulenta nu este ridicata.
Efectul citopatic
Multe virusuri distrug celula in care se replica generand uneori aspecte caracteristice atat in vivo cat si in vitro, desemnate ca efect citopatic.
Liza celulara. In unele cazuri, sub influenta proteinelor virale precoce (enzime) sinteza unor componente celulare poate fi afectata (oprita sau modificata). De asemenea, in cursul replicarii active a unor virusuri, se pot produce acumulari intracelulare de proteine capsidale care pot determina o inhibitie a biosintezei proteice virale si celulare. In consecinta se produce moartea celulara urmata de liza cu eliberarea unui numar mare de virioni.
Fuziunea celulara. Proteinele de fuziune implicate in patrunderea unor virusuri in celula pot cauza si formarea de celule gigante multinucleate (sincitii). In aceste cazuri, virionii trec de la o celula la alta fara a necesita liza celulara.
Corpii de incluziune. Incluziunile pot fi localizate intranuclear si / sau intracitoplasmatic. Natura lor este diferita in functie de agentul infectant :
- agregate de virioni maturi
- modificari degenerative, etc.
Modificarea antigenelor suprafetei celulare. Inducerea sintezei unor antigene celulare modificate este valabila mai ales in cazul virusurilor eliberate prin inmugurire. La suprafata celulei infectate apar astfel antigene codificate de genomul viral care functioneaza ca veritabili markeri si expun celulele respective atacului sistemului imun al gazdei.
B. Factori legati de gazda
Celulele pot fi infectate cu conditia existentei receptorilor specifici membranari (vezi 'Internalizarea').
In cazul patrunderii virusului in celula 'tinta', el trebuie sa se replice activ pentru a produce infectia, fapt ce nu se poate realiza decat cu conditia ca mediul celular intern sa fie propice initierii primului ciclu replicativ. Elementele implicate la acest nivel nu sunt inca pe deplin elucidate dar se pare ca temperatura si activitatile biochimice celulare sunt de importanta majora. In conditii suboptimale, replicarea virala poate fi totusi initiata rezultand insa particule virale incomplete cu capacitate scazuta de a infecta alte celule.
Alti factori legati de organismul gazda sunt :
- Varsta - poate influenta atat susceptibilitatea la anumite infectii cat si evolutia acestora
- Statusul imun
- Anumite stari fiziologice particulare (ex. sarcina)
- Sexul
- Starea de nutritie
- Afectiuni asociate .
Cu alte cuvinte, patrunderea virusului in organism nu presupune intotdeauna infectie, iar infectia virala nu presupune intotdeauna boala.
Principalele cai de intrare a virusurilor in organism sunt :
A. Tractul respirator . Infectiile virale cu poarta de intrare respiratorie sunt foarte frecvente si, in general, contagiozitatea acestora este extrem de ridicata datorita capacitatii de diseminare a particulelor virale infectante de la o gazda la alta pe cale aeriana. Aceste aspecte sunt favorizate de aglomerarile umane si de anotimpurile reci.
De mentionat ca, in unele cazuri, poarta de intrare nu coincide cu organul sau tesutul 'tinta'. Astfel, in cazul virusului varicelic, desi calea de intrare este tractul respirator, tinta principala este reprezentata de tegument
B. Tractul gastro-intestinal. Virusurile cu aceasta poarta de intrare sunt desemnate si ca virusuri cu transmitere fecal-orala, infectiile respective fiind, de regula, asociate cu conditii de igiena defectuoasa.
C. Tractul genito-urinar este calea de intrare a agentilor cu transmitere sexuala. Si in aceste cazuri poarta de intrare nu poate fi intotdeauna identificata cu localizarea si manifestarile infectiilor respective (ex. virusul hepatitei B, HIV).
D. Calea cutaneo-mucoasa. In general, tegumentul constituie o bariera eficienta in calea infectiilor bacteriene si a unor infectii virale. Totusi, unele virusuri sunt capabile sa traverseze acest obstacol producand fie infectii mai mult sau mai putin localizate la acest nivel (v. papilloma, v. herpes simplex) fie infectii generalizate.
In functie de extindere deosebim :
A. Infectii localizate
B. Infectii generalizate
Aceasta clasificare este desigur rigida, motiv pentru care este necesara mentiunea ca in multe cazuri infectia virala intereseaza cu precadere un anumit organ sau tesut (pentru care virusul respectiv poseda o afinitate crescuta = tropism) afectand insa in paralel si alte organe si tesuturi ale aceluiasi organism.
A. Infectii localizate.
In general este vorba de infectii ale suprafetelor epiteliale : tegument (poxvirusuri, papillomavirusuri), conjunctiva, membrane mucoase ale tractului respirator, gastrointestinal si genital. Desi replicarea virala este adesea restransa la aceste localizari, efectele pot fi de tip general (v. paragripale).
B. Infectii generalizate
Desi mecanismele patogenetice ale unor infectii virale generalizate nu sunt pe deplin elucidate, desfasurarea lor parcurge, de obicei urmatoarele etape :
- Patrunderea virionilor in organism - se produce, de obicei printr-o suprafata epiteliala ; la acest nivel are loc o replicare virala limitata.
- Migrarea virionilor catre ganglionii limfatici regionali - la acest nivel, o parte dintre virioni sunt neutralizati de macrofage
- Patrunderea virionilor restanti in sange - se realizeaza astfel viremia primara care poate determina simptome clinice (febra, stare generala alterata)
- Pe cale sanguina virionii ajung la ficat, splina, maduva osoasa - la aceste nivele se reia replicarea virala, rezultand un mare numar de virioni care eliberati in sange vor determina:
- Viremia secundara
- Pe cale sanguina virionii ajung la 'organul tinta' (cel pentru care virusul prezinta tropism) - la acest nivel se vor produce principalele simptome ale bolii.
In alte cazuri, infectiile generalizate se produc urmand o cale mai directa si mai rapida pana la organul tinta (de exemplu in cazul injectarii directe in torentul sanguin).
In functie de evolutie deosebim :
A. Infectii acute nepersistente (autolimitante)
B. Infectii persistente (latente)
C. Infectii insidioase cu evolutie letala
# B si C sunt desemnate ca infectii cronice.
Termenul de infectie cronica desemneaza situatia in care virusul este produs continuu in organism, cu sau fara integrarea ADN-ului viral in genomul celulei gazda.
A. Infectii acute nepersistente (autolimitante)
Majoritatea infectiilor virale acute se rezolva spontan (ex. hepatita A, gripa). Cu exceptia cazurilor de interesare a sistemului nervos (ex. poliomielita), sechelele sunt rare. In unele situatii, pot aparea complicatii severe sau chiar decese. Patogeneza unora dintre aceste complicatii nu este pe deplin elucidata dar reactiile de tip autoimun ar putea juca un rol important.
B. Infectii persistente (latente)
In unele cazuri, virusul poate persista in organism datorita persistentei ADN-ului viral (virusuri ADN, retrovirusuri care formeaza ADN complementar in cursul replicarii). ADN-ul viral poate fi integrat in genomul celulei gazda sau poate fi prezent sub forma episomala (molecula separata de ADN-ul gazdei). Evolutia ulterioara a acestui tip de infectie depinde in mare masura de raspunsul imun al gazdei. Acest tip de infectii virale cronice :
pot sa fie asimptomatice,
pot sa se reactiveze periodic generand episoade cu manifestari clinice de boala,
virusul infectant poate sa nu fie decelabil in perioadele asimptomatice, fiind insa decelabil in cursul episoadelor de reactivare,
unele dintre aceste infectii pot genera afectiuni maligne.
C. Infectii insidioase cu evolutie letala
Acest tip de evolutie caracterizeaza agenti desemnati ca 'slow' virusuri. In aceste cazuri este implicat mecanismul de 'toleranta imuna' care reprezinta incapacitatea sistemului imun de a recunoaste celulele infectate de virus ca fiind 'non-self'. Anticorpii care sunt produsi in cantitate redusa sunt incorporati in complexe antigen-anticorp. Aceste complexe imune formeaza depozite renale care stau la baza evolutiei letale tardive a acestor infectii.
Raspunsul imun face parte dintre mecanismele de aparare a organismului fata de agentii infectanti (Tabel .)
bel.. Mecanisme de aparare antivirala.
|
Tip de aparare |
Mecanism |
Exemple |
|
Aparare nespecifica |
Bariera fizica Bariere chimice Factori umorali Factori celulari |
-tegument, mucoase ; - acizi grasi, pH acid, mucus - complement, lizozim, interferoni, proteine de faza acuta (proteina C reactiva, beta 2- microglobulina) - flora asociata, celule NK |
|
Aparare specifica (Raspuns imun) |
Anticorpi Citotoxicitate mediata celular, activarea macrofagelor |
|
Raspunsul imun apare ca urmare a stimularii celulelor imunocompetente la contactul cu agenti straini de organism si care sunt recunoscuti ca atare ('non-self'). Agentii 'non-self' sunt antigene si prezenta lor in organism declanseaza in mod normal un raspuns specific din partea celulelor imunocompetente.
Celulele imunocompetente sunt :
-limfocitele T (T-helper, T-suppressor, T-citotoxice) - implicate in raspunsul imun de tip celular
-limfocitele B (responsabile de sinteza anticorpilor) - implicate in raspunsul imun de tip umoral.
Aceste celule, pe langa abilitatea de a face distinctia intre componentele proprii organismului (structuri 'self') si antigene ('non-self'), poseda asa-numita memorie imunologica. Conform acesteia, la un al doilea contact cu un antigen intalnit anterior, se declanseaza un raspuns imun eficient. Acest mecanism sta, de altfel, la baza imunizarilor specifice prin vaccinare.
A. Limfocitele B - Imunitatea specifica umorala.
Limfocitele B prezinta la suprafata lor molecule de anticorpi care reactioneaza la contactul cu antigenele specifice. Acest contact este favorizat de prezenta unor celule dendritice cantonate in ganglionii limfatici si in splina (APC - 'antigen-presenting cells') care alaturi de macrofge si monocite realizeaza o prelucrare a antigenului respectiv aducandu-l la o forma mai recognoscibila pentru anticorpii prezenti pe limfocitele B. De fapt, aceste procese au un grad inalt de specificitate, bazandu-se pe complementaritatea dintre anticorp si receptorul specific pentru acesta.
In urma 'intalnirii' limfocitele B prolifereaza generand o clona de celule cu aceeasi specificitate antigenica.
La acest proces participa si limfokinele secretate de limfocitele T-helper. Acestea sunt stimulate tot de antigenul 'prelucrat', pe baza existentei antigenelor de histocompatibilitate clasa II situate pe suprafata APC.
Multe dintre celulele unei astfel de clone se diferentiaza in celule efectoare (plasmocite) care secreta cantitati crescute de anticorpi ce se vor combina in mod specific cu antigenul respectiv. Cantitatea de anticorpi secretata este controlata de limfocitele T (vezi mai jos).
Tipurile de anticorpi (imunoglobuline) secretati de limfocitele B sunt : imunoglobuline clasa A (IgA), clasa M (IgM), clasa G (IgG), clasa D (IgD) si clasa E (IgE). Fiecare clasa de Ig este secretata de o clona celulara diferita de plasmocite. In cazul infectiilor virale se pare ca doar IgA, IgM si IgG ar prezenta importanta.
Structura si functiile imunoglobulinelor
O molecula de Ig poate fi compusa din una sau mai multe unitati constituite din 4 lanturi polipeptidice : 2 lanturi 'grele' ('heavy' - H) si 2 lanturi 'usoare' ('light' - L) care sunt dispuse sub forma literei 'Y'
In portiunile terminale ale celor doua 'brate' ale acestei molecule se remarca o mare variabilitate a secventelor aminoacidice. Aceste asa-numite 'regiuni hipervariabile' confera specificitatea antigenica a moleculei de Ig.
O imunoglobulina specifica poate actiona in mai multe moduri la contactul cu un virus. Principalele modalitati sunt :
1. Neutralizarea - se produce prin combinarea moleculei de anticorp cu virionul, combinare care are ca rezultat fie blocarea procesului de atasare indispensabil patrunderii virusului in celula, fie interferarea procesului de transcriptie a ARNm.
2. Citotoxicitatea celulara anticorpo-dependenta - se produce cu participarea complementului, prin combinarea intre anticorp si antigenul viral exprimat la suprafata unei celule infectate. Rezultatul este liza celulei infectate.
3. Opsonizarea - anticorpii se pot comporta ca opsonine prin combinarea cu virionii care determina cresterea capacitatii macrofagelor de a-i fagocita si distruge.
4. Activarea macrofagelor - macrofagele acoperite cu anticorpi specifici sunt activate (potentate) sa distruga celulele infectate care exprima antigene virale cu aceeasi specificitate.
B. Limfocitele T - imunitatea specifica mediata celular
Maturarea limfocitelor T se produce la nivelul timusului unde ele dobandesc receptorii cu specificitate de antigen. Unele subpopulatii limfocitare T secreta substante solubile (limfokine sau interleukine).
Principalele clase de limfocite T sunt :
1. Celule reglatoare - Acestea fie stimuleaza, fie inhiba activitatea altor tipuri de limfocite T sau B. Ele sunt desemnate ca limfocite T-helper si T-suppressor sau CD4 si, respectiv, CD8 (in functie de markerii de suprafata identificati cu anticorpi monoclonali).
2. Celule citotoxice - acestea joaca un rol important in infectiile virale, avand capacitatea sa recunoasca antigene virale la suprafata celulelor infectate. Modul de actiune este prin liza celulei infectate.
3. Celule NK (natural killer) - alaturi de celulele citotoxice si de macrofage, celulele NK actioneaza prin distrugerea celulelor care exprima antigene (ex. celule infectate, celule maligne, etc).
Interferon
Interferonii (IFN) sunt un grup de substante de natura glicoproteica ce prezinta proprietati antivirale, antitumorale si imunomodulatoare.
Activitatea antivirala a acestui grup de substante se bazeaza pe inhibarea multiplicarii virale prin blocarea translatiei ARNm viral si / sau prin degradarea preferentiala a acestuia.
La om exista 5 tipuri de IFN : alfa, beta, gamma, tau sI omega. Genele codante pentru sinteza acestora sunt situate pe cromozomul 9 (interferonii alfa, beta, tau sI omega) sI, respectiv pe cromozomul 12 (interferonul gamma).
Din punct de vedere biochimic, IFN-alfa sI -beta sunt monomeri cu structuri asemanatoare, iar IFN-gamma are structura homodimerica (compus din doua unitati monomerice identice. IFN-tau sI -omega au structuri asemanatoare cu IFN-alfa.
Sinteza de IFN in vivo este stimulata, in principal, de virusuri, alaturi de substante polinucleotidice, antigene, etc. Productia de IFN-alfa sI -beta are loc in majoritatea celulelor organismului, in timp ce sinteza IFN-gamma a fost evidentiata, pana in prezent doar in anumite tipuri de celule (limfocitele T CD8+, celulele NK).
Mecanismul de actiune antivirala al IFN (alfa, beta, gamma) este similar sI este legat de prezenta unor receptori IFN-specifici situati la nivelul majoritatii membranelor celulare.
Efectul antiviral este dat prin intermediul sintezei proteice induse de formarea complexului receptor-IFN care migreaza intracitoplasmatic (se internalizeaza). De altfel, majoritatea efectelor IFN, prin intermediul proteinelor sI enzimelor a caror sinteza o induc, sunt efecte de tip antiproliferativ viral sI celular. La acestea se adauga sI efectele antineoplazice realizate prin represarea unor oncogene.
Actiunea antivirala a enzimelor IFN-induse se produce prin mecanisme variate :
- interferarea (blocarea) replicarii virale prin clivarea ARNdc (dublu catenar),
- blocarea translatiei sI, deci, implicit blocarea sintezei proteinelor virale, - liza celulei gazda cu blocarea posibilitatii de infectare a altor celule,
- scaderea rezervelor de triptofan celular cu inhibarea cresterii celulare,
- inhibarea revers-transcriptazei (acest efect a fost recent evidentiat in cazul IFN-tau care are capacitatea de a inhiba revers-transcriptaza HIV).
Aplicatiile IFN in terapia antivirala s-au extins incepand cu anii '80. Rezultate bune s-au obtinut in infectii cronice cu HTLV, papillomavirusuri, virusuri hepatitice, etc.
Proprietatea majora a virusurilor este de a se multiplica in celula vie, astfel incat, in aplicarea chimioterapiei antivirale trebuie avute in vedere doua aspecte esentiale:
actiunea selectiva asupra virusului situat intracelular
absenta toxicitatii pentru celula gazda.
Chimioterapicele antivirale utilizate in prezent actioneaza la unul sau mai multe nivele ale multiplicarii virale:
1. inhiba initierea infectiei (prin prevenirea atasarii la receptorul celulei gazda) si decapsidarea
2. inhiba sinteza acizilor nucleici (ADN sau ARN), intervenind in biosinteza componentelor virale
3. inhiba ARNm, afectand sinteza proteinelor structurale si asamblarea corecta a virionului progen
4. inhiba polimerazele virale
5. inhiba reverstranscriptaza.
Inhibitori ai initierii infectiei virale
AMANTADINA si RIMANTADINA sunt amine ciclice (Rimantadina este un compus alfa-metilat al Amantadinei). Actioneaza in special asupra virusurilor gripale tip A (virusurile gripale tip B si C nu sunt sensibile). Se administreaza pe cale orala.
Mecanisme de actiune: inhiba patrunderea si decapsidarea virusurilor gripale tip A sau inhiba asamblarea virala. "In vivo" si "in vitro" s-au selectat mutanti rezistenti.
Indicatii : Amantadina se administreaza profilactic fata de infectiile cu virus gripal tip A. Daca se administreaza cu 48 de ore inaintea debutului, simtomatologia clinica se reduce cu 50-90%.
Indicatiile principale sunt:
-indivizi cu imunodepresie
-indivizi nevaccinati cu risc crescut de infectie
-indivizi alergici la urmele de ovalbumina din vaccinul antigripal.
Reactii adverse:
Amantadina : tulburari nervoase, insomnii, iritabilitate, delir.
Rimantadina este mai putin toxica.
Inhibitori ai sintezei acizilor nucleici (analogi nucleozidici)
ADENIN-ARABINOZID (VIDARABINA sau "ARA-A") este un analog al adenozinei. Se administreaza intravenos sau ca unguent.
Mecanismul de acttune: inhiba atat sinteza ADN-ului viral cat si al celulei gazda, dar ADN-ul viral este de 6-12 ori mai sensibil. Scade fosforilarea nucleozidelor de catre enzimele celulare si se incorporeaza in structura ADN.
Indicatii: (actioneaza asupra herpesvirusurilor si poxvirusurilor)
-scade mortalitatea in encefalita herpetica
-keratita herpetica
-indivizi cu imunodepresie la care atenueaza formele severe de varicela si herpes-zoster
Reactii adverse:
-greturi, varsaturi, tranzit digestiv accelerat
-tulburari nervoase (parestezii, convulsii)
-rar: trombocitopenie sau leucopenie.
Se evita administrarea in insuficienta renala.
ACYCLOVIR (ACV) reprezinta un analog al guanosinei (ZOVIRAX sau ACICLOGUANOSINA). Efectul antiviral este limitat numai la virusul herpes simplex si virusul varicelo-zosterian.
Este convertit in compus monofosforilat numai de catre o enzima codificata de virus (timidinkinaza). Medicamentul este activ numai la acyclovir trifosfat fiind activat selectiv si eficient de timidinkinaza virala, care aditioneaza numai primul grup fosfat, in continuare fosforilarea fiind realizata de enzimele celulare. Aditia primului grup fosfat este o etapa absolut indispensabila pentru activarea acyclovirului si reactia are loc numai in celulele infectate (de aici specificitatea actiunii). Inhiba ADN polimeraza virala si sinteza de ADN viral in care se incorporeaza. Are toxicitate scazuta pentru celula. Se administraza oral (per os), intravenos sau ca unguente.
Indicatii:
-indivizi cu imunodeficiente, infectati cu virusul herpes simplex tip 1 si 2 si virusul varicelo-zosterian
-la pacientii cu transplante de maduva previne boala, atenueaza simtomele, scurteaza durata si reduce eliminarea de virus
-complicatii oculare herpetice
Desi este un medicament activ in herpesul primar, nu are efect asupra herpesului recurent, fiind inactiv asupra virusului latent.
Reactii adverse:
-se administreaza cu precautii la bolnavii cu afectiuni renale
-la bolnavii de SIDA pot aparea mutante rezistente deficiente in timidinkinaze.
Un derivat al acyclovirului, activ atat pe virusul herpes simplex cat si pe virusul cytomegalic, este GANCYCLOVIR-ul (derivat al guanosinei).
Mecanism de actiune: inhiba sinteza ADN-polimerazei si a ADN-ului viral. Se administreaza intravenos.
Indicatii:
-infectii cu virus cytomegalic (retinita)
-la pacienti cu imunodepresie (SIDA)
-tratamentul herpesului rezistent la Acyclovir.
Reactii adverse: neutropenie reversibila si leucopenie.
FAMCYCLOVIR - analog al timidinei a dat rezultate bune in infectii cu virusul varicelo-zosterian, fiind mult mai activ decat Acyclovir-ul.
RIBAVIRIN - derivat al guanosinei.
Are un spectru antiviral larg, actionand asupra unor virusuri ADN dar si ARN.
Mecanism de actiune:
-inhiba sinteza de ADN si ARN, prin scaderea guanosin-trifosfatului intracelular
-inhiba initierea sintezei de ARNm
-inhiba sinteza de ARN-polimeraza virala.
Se administreaza oral, intravenos, ca aerosoli.
Indicatii:
- in febra de Lassa reduce mortalitatea si scade viremia
- tratamentul infectiilor cu virusurile gripale tip A si B, virusul sincitial respirator (la copii), virusul rujeolic. In toate aceste cazuri, atenueaza simptomatologia, scade eliminarea virusului.
Reactii adverse:
-anemie dupa administrare intravenoasa
-conjunctivita si rash dupa administrare ca aerosoli.
IDOXIURIDIN (IUDR) este un derivat halogenat al deoxiuridinei, ce actioneaza asupra virusurilor ADN.
Mecanism de actiune:
Se substituie timidinei rezultand un ADN ce sintetizeaza proteine virale alterate.
Indicatii:
- in keratita herpetica, sub forma de solutii oftalmice aplicate local.
Reactii adverse: toxicitate relativ crescuta.
Inhibitori ai ARNm
METISAZONA - activa mai ales asupra poxvirusurilor.
Mecanism de actiune:
- inhiba sinteza ARNm tardiv deci previne sinteza proteinelor structurale si formarea virionilor infectanti. Se administreaza oral.
Indicatii:
- profilaxia infectiei variolice (ATENTIE: - nu are actiune terapeutica dupa debutul bolii).
Inhibitori ai polimerazelor virale
FOSCARNET(acidul fosfonoacetic) - analog al pirofosfatului (fosfat anorganic).
Mecanism de actiune:
- inhibitor specific al ADN polimerazei herpes virusurilor, fara actiune pe polimerazele celulare. Se ataseaza direct de situs-urile de legare ale pirofosfatului la ADN si ARN polimerazele virale (inhiba legarea ADN-polimerazelor si a reverstranscriptazei de substrat). Se administreaza intravenos.
Indicatii:
-infectii herpetice din SIDA, rezistente la Acyclovir
-retinite determinate de virusul citomegalic in SIDA. Eficacitatea fata de HIV se exprima prin scaderea antigenemiei si cresterea numarului limfocitelor T (CD4-pozitive), dar fenomenele sunt tranzitorii.
Reactii adverse:
- perturbari ale functiilor renale
- perturbari ale echilibrului electrolitilor (Ca, K, Mg)
-convulsii.
Se acumuleaza in organism si are efecte secundare toxice. Aparitia mutantelor virale rezistente este relativ frecventa.
Inhibitori ai reverstranscriptazei
ZIDOVUDINE (RETROVIR, AZIDOTIMIDINA = AZT- analog pirimidinic sintetic care inhiba retrovirusurile (inhiba replicarea HIV "in vitro" si amelioreaza simptomatologia bolnavilor in stadiile precoce ale bolii).
Mecanism de actiune:
- este substrat pentru timidinkinaza pe care o converteste in compusi inhibitori ai reverstranscriptazei si intrerupe elongatia AND viral in cursul replicarii. Se administreaza oral.
Indicatii:
- in infectii cu HIV
- la bolnavii cu SIDA determina o crestere a limfocitelor T (CD4-pozitive), scaderea antigenemiei si cresterea ratei de supravietuire.
Reactii adverse:
- febra, rash, granulocitopenie, anemie, tulburari nervoase.
Exista riscul aparitiei mutantelor virale, mai ales in cazul utilizarii dozelor mici de medicament.
DIDANOZINA - analog al deoxiadenozinei.
Mecanism de actiune:
- inhiba, prin competitie, reverstranscriptaza. Se administreaza oral.
Indicatii:
- infectia HIV.
Reactii adverse:
- nevralgii periferice, diaree.
Contraindicata la bolnavii cu risc de pancreatita.
Virusurile defective sunt virusuri care nu se pot replica autonom, necesitand prezenta unui asa-numit virus 'helper' pentru a putea infecta si a se putea replica in organismul infectat. Uneori infectia asociata virus 'helper' - virus defectiv poate fi deosebit de severa. Se pare ca in aceste cazuri actiunea virusului helper este potentata si efectele sale sunt amplificate de prezenta virusului defectiv. In alte cazuri aceste asocieri nu par sa evolueze diferit de infectiile unice cu virusul helper respectiv.
Recent s-au descoperit noi clase de agenti infectiosi : viroizii si prionii. Este vorba de cele mai mici particule cauzatoare de imbolnaviri, cunoscute pana in prezent. Viroizii afecteaza celulele vegetale si ei sunt compusi dintr-o molecula neinvelita de ARN circular, monocatenar, covalent inchis cu lungimi reduse (200-300 nucleotide sau chiar mai putin). Cu toate acestea viroizii sunt capabili sa se replice autonom.
Prionii difera atat de virusuri cat si de viroizi prin faptul ca nu contin acizi nucleici. Se pare ca proteinele prionice sunt codificate de gene celulare. Exista aspecte care sugereaza ca prionii ar putea fi implicati in afectiuni cum sunt maladia Creutzfeld-Jacob, kuru, etc.
Metodele principale ale diagnosticului de laborator al infectiilor virale sunt :
A. Examenul citologic
B. Microscopia electronica
C. Izolarea si cultivarea virusurilor
D. Decelarea de proteine virale
E. Metode serologice
F. Decelarea de material genetic
A. Examenul citologic
Constituie o metoda rapida de diagnostic virusologic ce presupune identificarea efectelor produse asupra structurilor celulare. Desigur, metoda este aplicabila doar in cazul virusurilor care determina modificari caracteristice la nivelul celulelor infectate (efect citopatic). Astfel de modificari sunt, de exemplu :
-modificari morfologice
-liza celulara
-vacuolizarea
-inducerea formarii de sincitii (conglomerate de celule fuzionate)
-formarea de incluziuni (modificari ale unor structuri celulare intranucleare sau intracitoplasmatice)
B. Microscopia electronica
Este o metoda de detectare si identificare a unor virusuri, cu conditia ca numarul de virioni prezenti in proba examinata sa fie suficient.
Prin adaugarea de anticorpi specifici virali intr-o proba se poate facilita detectarea si identificarea simultana a virusului, datorita producerii reactiilor specifice antigen-anticorp (imunomicroscopie electronica).
C. Izolarea si cultivarea virusurilor
O serie de virusuri pot fi introduse si cultivate in culturi de celule. Alegerea, pe de o parte, a produsului patologic si, pe de alta parte, a tipului de mediu celular de cultivare, sunt orientate de datele clinice si epidemiologice care contureaza un diagnostic preliminar, prezumptiv. In functie de acesta, deci de agentul viral banuit, se va alege de asemenea si momentul recoltarii produsului patologic (in concordanta cu etapele mecanismului patogenic). De regula, momentul recoltarii trebuie sa fie cat mai precoce (cat mai curand dupa debutul bolii), cu atat mai mult cu cat anticorpii produsi ca raspuns la infectie pot bloca detectarea virusului.
a. Cultivarea. Virusurile se pot cultiva in culturi de tesuturi, pe oua embrionate sau prin inoculare la animale de expreienta.
Pentru cultivarea virusurilor se folosesc diferite tipuri de culturi celulare :
-Culturi celulare primare - obtinute din organe animale prin disociere enzimatica (tripsina, colagenaza) ; celulele sunt cultivate sub forma de monostrat sau sub forma de suspensie in medii de sinteza imbogatite cu factori de crestere (ser bovin).
-Culturi celulare secundare - obtinute prin disocierea culturilor celulare primare cu tripsina, urmata de transfer sau pasaj.
-Tulpini celulare diploide - obtinute prin cultivarea unui singur tip celular, apte de a suporta un numar finit de pasaje (transferuri) pana la constatarea unor modificari semnificative.
-Linii celulare - obtinute prin cultivarea de celule tumorale sau de celule imortalizate sub actiunea virusurilor sau a unor substante chimice, apte de a suporta un numar infinit de pasaje fara a suferi modificari.
Exemple :
- Cultura primara de celule renale de maimuta - cultivarea de othomyxovirusuri, paramyxovirusuri, unele enterovirusuri, unele adenovirusuri.
- Cultura de celule diploide fetale - cultivare de herpesvirusuri, picornavirusuri, adenovirusuri.
b. Detectarea. Detectarea si identificarea virusurilor in culturi celulare se face initial prin observarea tipului de efectului citopatogen :
- moartea celulara : rotunjire - degenerare - agregare - desprinderea de substratul (suportul) de cultura
- modificari histologice : incluziuni nucleare sau citoplasmatice, sincitializarea (celule gigante multinucleate formate prin fuziune celulara)
- modificari celulare de suprafata : exprimare de antigene virale, hemadsorbtie.
Pe baza tipului de cultura celulara, a efectului citopatogen si a timpului de crestere virala se realizeaza indentificarea initiala in cazul multor virusuri.
Exista insa virusuri care nu pot fi detectate si identificate in acest mod deoarece ele fie nu produc efect citopatogen direct, fie cresc extrem de lent, fie nu cresc de loc in culturi de celule.
In cazul absentei efectului citopatogen direct, identificarea initiala in culturi de celule a unor virusuri se poate realiza pe baza unor efecte indirecte :
- Interferenta heterologa - proces prin care replicarea unui virus interfereaza (inhiba) replicarea unui alt virus ; in cultura celulara, identificarea se va face pe baza absentei efectului ciotopatogen al virusului interferat.
- Hemadsorbtia - celulele infectate cu anumite virusuri exprima antigene virale (hemaglutinine) care leaga eritrocitele anumitor specii animale.
- Hemaglutinarea - prezenta virusului determina aglutinarea eritrocitelor.
c. Interpretarea rezultatelor. De obicei, detectarea si identificarea unui virus intr-o proba constituie un diagnostic de certitudine. Totusi, rezultatele obtinute prin aceasta metoda nu trebuie absolutizate si ele trebuie corelate cu contextul clinic si epidemiologic al cazului.
De asemenea, un rezultat negativ nu exclude neaparat infectia virala suspicionata (motive legate de recoltare, transport neadecvat al produselor patologice, prezenta anticorpilor neutralizanti in cazul recoltarii tardive a produsului patologic, etc) .
D. Decelarea de proteine virale
In cursul replicarii virale sunt produse proteine specifice care pot fi decelate prin metode :
-biochimice
-imunologice
-de biologie moleculara.
- Metode biochimice - proteinele virale pot fi supuse electroforezei. Tiparele ('pattern-urile') electroforetice obtinute pot fi apoi utilizate pentru identificarea prin comparare a diferitor virusuri. Detectarea unor enzime poate indica prezenta unor tipuri sau genuri virale (exemplu : prezenta revers-transcriptazei indica prezenta unui retrovirus).
- Metode imunologice - Prin utilizarea de anticorpi specifici marcati pot fi identificate antigene virale prezente in produse patologice sau in culturi celulare. Marcarea anticorpilor se poate realiza cu substante fluorescente, radioactive sau cu enzime.
- Metode de biologie moleculara - sunt folosite pentru decelarea si identificarea materialului genetic viral.
a) Sondele ADN marcate - constituie o metoda sensibila si specifica de detectare a unor genoame virale. Metoda se bazeaza pe complementaritatea intre secventa sondei ADN si cea a unei regiuni specifice a genomului viral. Principiul este asemanator celui care sta la baza detectarii antigenelor prin anticorpi specifici marcati.
Marcarea sondelor ADN se realizeaza cu nucleotide tratate radioactiv sau chimic.
b) Hibridizarea in situ - detectarea de secvente genomice virale specifice in biopsii de tesuturi folosind sonde ADN
c) Tehnici de hibridizare de tip 'dot blot' - au la baza tot utilizarea sondelor ADN si folosesc drept suport filtre de nitroceluloza.
-'Southern blot' - hibridizare ADN-ADN : ADN-ul viral este separat electroforetic, transferat apoi pe un filtru de nitroceluloza si apoi identificat pe baza mobilitatii electroforetice specifice si prin hibridizare cu o sonda ADN specifica marcata
-'Northern blot' - hibridizare ARN-ADN : ARN-ul viral este separat electroforetic, transferat pe un filtru de nitroceluloza si detectat prin sonda ADN specifica marcata
d) Polymerase chain reaction (PCR) - are la baza mecanismul de replicare semiconservativa a ADN. Proba de analizat se incubeaza impreuna cu doi oligomeri ADN, complementari cu capetele unei secvente cunoscute a genomului viral, care, prin hibridizare vor servi drept 'amorse' ('primeri') pentru ADN-polimeraza virala, determinand copierea unui segment ADN.
Prin incalzirea probei se obtine apoi denaturarea ADN (separarea celor doua catene), dupa care prin racire se faciliteaza hibridizarea amorselor la noul lant ADN. Fiecare copie se va comporta ca matrita pentru sinteza de noi lanturi ADN. Procesul continua ciclic ducand la o amplificare exponentiala (milioane de copii) a secventei ADN initiale (originale).
Aceasta tehnica este utila mai ales pentru detectarea virusurilor in infectii latente sau cu secvente ale genomului viral integrate in genomul celulei gazda (retrovirusuri, herpesvirusuri, etc).
E. Metode serologice .
Sunt utile in cazul virusurilor ce nu pot fi cultivate in culturi celulare si in cazul infectiilor virale cu evolutie lenta (de exemplu, virusurile hepatitice, HIV, arbovirusuri). De asemenea, serologia este utila pentru stabilirea raspunsului imun in infectii virale.
Principalele tipuri de teste serologice folosite in diagnosticul infectiilor virale sunt :
1. Reactia de fixare a complementului
2. Reactia de hemaglutinoinhibare
3. Reactia de neutralizare
4. Imunofluorescenta directa si indirecta
5. Latex-aglutinarea ; Hemaglutinarea pasiva
6. Reactiile imunoenzimatice (ELISA - 'enzyme-linked immunosorbent assay') ; Testele Western blot
7. Teste radioimune (RIA)
1. Reactia de fixare a complementului.
Serul este pus in contact cu antigen viral si complement in cantitate cunoscuta. In cazul prezentei anticorpilor specifici in serul de cercetat, formarea complexelor antigen-anticorp va determina activarea si fixarea complementului. Prin adaugarea de eritrocite marcate cu anticorpi anti-eritrocitari se determina prezenta de complement liber (nefixat).
Rezultat negativ - prezenta de complement liber (nefixat) tradusa prin hemoliza
Rezultat pozitiv - absenta complementului liber, datorita fixarii sale in complexele antigen viral-anticorp specific-complement, tradusa prin absenta hemolizei
2. Reactia de hemaglutino-inhibare si 3. Rectia de neutralizare
Se deceleaza legarea anticorpilor specifici de virus. Acest proces blocheaza posibilitatea de legare a virusului la celule 'martor' (eritrocite).
5. Latex-aglutinarea ; Hemaglutinarea pasiva
Deceleaza anticorpi sau antigene solubile.
Anticorpii specifici antivirali determina aglomerarea particulelor de latex acoperite cu antigene virale sau, invers, antigene solubile virale determina aglomerarea particulelor de latex acoperite cu anticorpi specifici.
In cazul hemaglutinarii pasive principiul este acelasi, dar in loc de particulele de latex sunt utilizate hematii.
6. Reactiile imunoenzimatice
In cazul testelor de decelare a anticorpilor specifici antivirali, se utilizeaza antigene fixate pe un suport solid inert (nitroceluloza, polistiren, latex, etc). In contact cu serul de cercetat, aceste antigene vor fixa anticorpii specifici. Detectarea acestor anticorpi specifici antivirali se face prin adaugarea unui anticorp anti-imunoglobulina umana, marcat prin legarea covalenta cu o enzima (peroxidaza, fosfataza alcalina, etc). Se formeaza astfel un complex :
antigen - anticorp seric - anticorp antimunoglobulina umana - enzima.
Detectarea prezentei acestui complex (deci implicit a prezentei anticorpilor serici specifici antivirali) se face prin adaugarea substratului enzimei respective si analiza spectrofotometrica a intensitatii culorii rezultate prin reactia enzima-substrat.
In cazul testelor ELISA de decelare a antigenelor virale, principiul reactiei este acelasi cu exceptia faptului ca, pe suportul solid al reactiei, sunt fixati anticorpi specifici antivirali.
O varianta a ELISA sunt testele Western blot. Proteinele virale sunt separate prin electroforeza, ele migrand conform greutatii lor moleculare sau sarcinii electrice si fiind transferate (sub forma de 'pete'-'blot-uri') pe un suport solid inert (nitroceluloza). In contact cu serul de cercetat, aceste fractiuni proteice virale vor fixa anticorpii specifici. Vizualizarea acestor reactii antigen-anticorp se realizeaza prin adaugarea de anticorpi antiimunoglobulina umana marcati enzimatic.
7. Teste radioimune.
Se utilizeaza anticorpi sau antigene marcate redioactiv pentru detectarea complexelor antigen-anticorp.
Atat ELISA cat si RIA se pot realiza sub forma de teste de captura antigenica, respectiv captura de anticorpi, dupa cum s-a descris mai sus, sau sub forma de teste competitive. In cazul testelor de tip competitiv, anticorpii din serul de cercetat sunt detectati (si pot fi cuantificati) pe baza competitiei lor cu anticorpi de sinteza.
Acest document nu se poate descarca
| E posibil sa te intereseze alte documente despre: |
| Copyright © 2024 - Toate drepturile rezervate QReferat.com | Folositi documentele afisate ca sursa de inspiratie. Va recomandam sa nu copiati textul, ci sa compuneti propriul document pe baza informatiilor de pe site. { Home } { Contact } { Termeni si conditii } |
Documente similare:
|
Cauta document |