CROMATOGRAFIA PE HARTIE - Separarea si analiza calitativa a unor specii chimice anorganice si organice

CROMATOGRAFIA PE HARTIE

Separarea si analiza calitativa a unor specii chimice anorganice si organice

In cromatografia pe hartie, faza stationara este constituita din hartia cromatografica propriu-zisa, impreuna cu solventul ( apa, formamida, etc.) cu care se imbiba (in unele cazuri), iar faza mobila este formata din solventul sau amestecul de solventi care migreaza pe hartie.

Hartia este un material format din fibre aranjate intimplator. Acest pachet de fibre formeaza un mediu poros pe care se fixeaza faza stationara iar spatiile dintre fibre constituie canale de scurgere ale fazei mobile. Dimensiunile capilare ale acestor canale constituie atat o rezistenta la scurgerea solventului cat si o cauza a ascensiunii capilare.

Prin cufundarea hartiei intr-un solvent, acesta urca sau coboara in functie de aranjarea hartiei (cromatografie ascendenta sau descendenta) prin manunchiul de capilare care constituie structura poroasa a hartiei, tragand dupa el o coloana de lichid, care antreneaza la rindul ei migrarea particulelor probei.

Hartia cromatografica are la baza celuloza, dar in ultimul timp diversitatea materialelor folosite a crescut mult. Ele se prezinta sub denumiri comerciale: Whatman, Schieicher-Schull, Erdol, etc., cu grosimi si porozitati diferite, acetilate, carboxilate, impregnate cu kieselghur, cu silicon, cu schimbatori de ioni, etc.

Faza mobila Cromatografia pe hartie poate fi considerata in primul rand ca o cromatografie de repartitie lichid-lichid in care hartia functioneaza ca un suport pentru sistemele de solventi.

Sistemele de solventi utilizate in cromatografia pe hartie sunt multiple, avandu-se in vedere miscibilitatea limitata a unora dintre ei. Din punctul de vedere al fazei stationare sistemele de solventi se pot imparti in trei grupe:

a)   o faza stationara apoasa;

b)   o faza stationara formata dintr-un solvent organic hidrofil;

c)   o faza stationara formata dintr-un solvent organic hidrofob.

Mecanismul migrarii zonei in cromatografia pe hartie

Migrarea zonei (componentelor probei) depinde de natura fortelor care actioneaza asupra componentului, deci de mecanismul predominant care este cel al repartitiei lichid-lichid. Datorita dificultatilor de evaluare a factorilor implicati in mecanismul de migrare al zonei s-a convenit ca evaluarea separarii cromatografice sa se faca prin masurarea valorii R_f (vezi fig. 3)

R_f = distanta parcursa de zona (a) distanta parcursa de solvent (b)

a - distanta parcursa de zona; se masoara de la mijlocul zonei (pata, spot) pana la linia de start (cm); b -distanta parcursa de solvent; se masoara de la linia de start (locul in care s-a aplicat proba) pana la frontul eluentului trecand prin mijlocul zonei (cm).

Camerele de developare (fig. 4) sunt vase de sticla de forme si dimensiuni diferite (1), inchise etans cu un capac sau o placa de sticla (2) si care au in interior dispozitive de suspendare a hartiei cromatografice (3).

a.   vase continind faza polara (apoasa) pentru saturarea
cu vapori a camerei;

b.   faza mobila (organica);

c.   punctele de aplicare a probelor pe linia de start;

d.   zonele migrate ale componentilor;

e.   linia frontului;

f.    hartia cromatografica.

TEHNICA EXPERIMENTALA

Pregatirea benzilor cromatografice si aplicarea probei

Se alege sortul de hartie cromatografica corespunzator scopului urmarit. Se determina sensul de migrare pe coala de hartie cromatografica aplicand o picatura de apa distilata intr-un colt al hartiei; sensul de migrare este cel indicat de alungirea petei. Tinandu-se cont de sensul de migrare se taie benzile de hartie cromatografica in functie de dimensiunile vasului cromatografic. Se MARCHEAZA FIN cu creionul, pe cele doua margini ale hartiei linia de start (1,5 cm de la marginea inferioara a hartiei).

Aplicarea probelor se efectueaza cu o micropipeta de 0,1 ml divizata in 0,001 ml (la care este montata seringa), cu o seringa Hamilton de 100 μl, capilare de sticla calibrate sai necalibrate sau cu pipete Pasteur bine efilate. In toate cazurile diametrul spotului trebuie sa nu fie mai mare de 0,5 cm. Daca este necesara aplicarea unei cantitati mai mari de proba se usuca si se aplica din nou alta cantitate de proba de aceeasi dimensiune. Probele se aplica pe linia de start la o distanta de minimum 2 cm una de alta (se marcheaza cu creionul).

Pregatirea camerelor cromatografice

Camerele cromatografice trebuie sa fie saturate cu vaporii fazei mobile ( de aceea eluentul se introduce in incinta camerei inainte de a pregati hartia cromatografica). In cazul in care faza mobila este constituita din solventi nemiscibili, se separa cu o palnie de separare, faza apoasa de cea organica. Faza organica (care constituie eluentul propriu-zis) se introduce in vas in asa fel incat sa formeze un strat de 0,5 cm, iar faza apoasa se introduce in recipiente mici de sticla care se asaza in interiorul vasului in asa fel incat in momentul introducerii hartiei, aceasta sa nu le atinga. Camera cromatografica se inchide etans si se lasa sa se satureze cu vaporii eluentului (pana cand se pregateste hartia cromatografica si se aplica probele).

Benzile de hartie pe care s-au aplicat probele se introduc in camera cromatografica suspendandu-se de dispozitiv, avand grija ca hartia sa patrunda in eluent, iar eluentul sa nu ajunga la linia de start. Aceasta operatie se executa cat mai repede posibil pentru a nu tine prea mult timp deschisa camera cromatografica, ce a fost in prealabil saturata cu vaporii eluentului.

Developarea se face la o temperatura constanta 20 - 25° C pana cand frontul de eluent a ajuns la o inaltime corespunzatoare, in momentul scoaterii hartiei din camera cromatografica (dupa developare) se noteaza cu un creion pozitia frontului, apoi se usuca intr-un curent de aer cald.

Vizualizarea cromatogramelor se efectueaza prin pulverizarea unor reactivi potriviti care conduc la aparitia unor pete (spoturi) colorate.

Calcularea R_f-ului se face conform formulei de mai jos, masurand distanta de la mijlocul spotului pana la punctul de start (a) si pana la linia frontului (b).

Evaluarea cromatogramelor Evaluarea cantitativa a cromatogramelor se poate face in mai multe feluri si anume:

densitometric: Densitometrele sunt niste microspectrofotometre care permit estimarea cantitativa a unui component pe baza reflexiei sau transmisiei luminii pe suprafata spotului;

spectrofotometric: Se decupeaza spotul cu o foarfeca si se taie in mici fragmente care se introduc intr-un solvent potrivit, iar solutiei obtinuta i se citeste extinctia la un spectrofotometru;

metode semicantitative: Masurarea suprafetei spotului (cu un planimetru) si calcularea concentratiei dupa relatia

A_s = k log M_s unde A_s - aria spotului; k - constanta; M_s - masa de substanta din spot.

Masurarea suprafetei spotului (A_s) se poate face si cu ajutorul hartiei milimetrice, de preferinta transparenta.

In practica curenta eficienta separarilor cromatografice se apreciaza in functie de substante etalon (de referinta) carora li se determina R_f-ul. Acestea se aplica pe aceeasi hartie cromatografica, alaturi de proba.

ACTIVITATE PRACTICA

Sa se separe prin tehnica cromatografica ascendenta, pe hartie, un amestec format din: tiouree, feniltiouree si difeniltiouree;

Sa se separe prin aceeasi tehnica, un amestec format din ionii: Co²⁺,Ni²⁺ si Cu²⁺

1) SEPARAREA CROMATOGRAFICA PE HARTIE A AMESTECULUI DE TIOUREE, FENILTIOUREE SI DIFENILTIOUREE

Pregatirea camerei cromatografice Eluentul: n-butanol-acid acetic-apa (4:1:5, v/v). Cu o palnie de separare se separa faza apoasa, aflata in partea inferioara, de faza organica cu densitate mai mica. Faza organica (n-butanol saturat cu acid acetic si apa) se introduce in vas pana se formeaza un strat de aproximativ 2 cm. Faza apoasa (acid acetic - apa saturata cu n-butanol) se introduce in doua recipiente mici de sticla, care se asaza pe fundul vasului. Camera cromatografica se inchide etans cu o placa de sticla.

Aplicarea probelor Pe o banda de hartie cromatografica Whatman nr. 4 avind dimensiunile 13,5 x 10 cm se aplica pe linia de start (1,5 cm de la margine) spoturi din solutiile de tiouree, feniltiouree si difeniltiouree-etalon si amestecul lor. Spoturile se aplica fie cu o pipeta Pasteur, fie cu o micropipeta, la 2 cm distanta unul de altul in asa fel incat diametrul spotului sa nu depaseasca 0,5 cm. Dupa uscare (cu foen-ul) se repeta operatia.

Banda de hartie cromatografica se suspenda pe suport (vezi fig. 2) si se introduce in camera cromatografica avind grija ca eluentul sa nu ajunga la linia de start. Operatia aceasta se face cat mai repede si se inchide camera etans.

Developarea se face la temperatura camerei (20- °C) timp de 2 ore dupa care banda de hartie se scoate din camera cromatografica si se noteaza cu un creion linia frontului, dupa care se usuca intr-un curent de aer cald.

Vizualizarea spoturilor se face prin pulverizarea pe cromatograma, in mod uniform, a unei solutii amoniacale de AgNO₃, ([Ag(NH₃)₂]OH) cand apar niste pete colorate in brun.

Forma tionica  Forma tiolica Complex brun

R = H tiouree

R = H si C₆H₅    feniltiouree
R = C₆H₅ difeniltiouree

Dupa uscare se determina valorile R_f atat la substantele de referinta cat si la substantele separate din amestec. Datele experimentale se trec in tabelul de mai jos, iar la rubrica Observatii se interpreteaza rezultatele.

Tabelul nr.1

Observatii:

2). SEPARAREA CROMATOGRAFICA PE HARTIE A AMESTECULUI DE Co²⁺, Ni²⁺ Sl Cu²⁺

Se utilizeaza camera cromatografica de dimensiuni mai mici.

Eluentul: Acetona - acid clorhidric concentrat (100:1,5 v/v) se introduce in camera cromatografica pana formeaza un strat de aproximativ 5 mm si se inchide etans cu capacul de sticla

Aplicarea probelor Pe banda de hartie cromatografica Whatman nr.4 de dimensiunile 19,5 x 10 cm se aplica pe linia de start spoturi din solutiile de Co²⁺, Ni²⁺ si Cu²⁺ precum si amestecul lor, cu ajutorul capilarelor de sticla necalibrate, la distante de 2 cm, spotul avand un diametru maxim de 0,5 cm. Dupa uscare, operatia se repeta de 3-4 ori.

Banda de hartie se ruleaza sub forma unui cilindru. Se capseaza cele doua margini la partea inferioara si superioara avand grija ca acestea sa nu se suprapuna, dupa care cilindrul de hartie se introduce in camera in asa fel incat eluentul sa nu ajunga la linia de start.

Developarea are loc la temperatura camerei, pe o distanta de minim 10 cm, dupa care banda cromatografica se scoate din camera si se noteaza linia frontului. Dupa uscare vizualizarea spoturilor se face prin pulverizare cu acid rubeanic si expunere la vapori de NH₃, cand apar spoturi colorate diferit: galben pentru Co²⁺, albastru-violet pentru Ni²⁺ si verde pentru Cu²⁺.

Datele experimentale se trec in tabelul de mai jos interpretarea rezultatelor facandu-se la rubrica Observatii.

Tabelul nr.2

Observatii: