Multiplicarea virusurilor

MULTIPLICAREA VIRUSURILOR

Virusurile reprezinta o categorie aparte de agenti infectiosi, a caror multiplicare se face exclusiv in celule vii-gazda, care furnizeaza nu numai materialul de constructie dar si intregul "dispozitiv" celular necesar pt reproducerea particulelor virale.

Virusul invadant introduce in celula-gazda informatia specifica a propriului sau genom, care deviaza metabolismul celular in asa fel incat, in loc sa se mai formeze constituenti celulari, se face sinteza unor enzime speciale necesare pentru fabricarea de produsi virali. Multiplicarea virusului reprezinta deci o consecinta a introducerii in celula a unui acid nucleic strain, cu proprietati biologice specifice. Procesul decurge intr-o serie de etape succesive 1). absorbtia si fixarea virusului pe celula-gazda; 2). patrunderea virionilor in celula; 3). replicarea genomului viral in celula-gazda; 4) sinteza proteinelor virale si morfogeneza virionului; 5). liberarea din celula a particulelor virale progene.

Absorbtia si fixarea virusurilor pe celula. Pentru a patrunde eficient in celula, virusul trebuie sa dispuna de un mecanism care sa-i asigure fixarea pe celula-gazda pana in momentul cand este inglobat in ea. Acest mecanism variaza nu numai dupa morfologia virusului, dar si in functie de celula-gazda. Una dintre particularitatile virusurilor - specificitatea lor pentru anumite gazde - este in primul rand o specificitate de fixare. Intr-adevar, daca in locul unui virus se utilizeaza experimental pentru infectare numai acidul lui nucleic pur, debarasat de capsida, pentru a se evita fixarea, gama celulelor receptive la acel virus creste. Structura cea mai adecvata pentru fixare este aceea a bacteriofagului, care de aceea si are un inalt grad de specificitate fata de celula-gazda.

Virusurile plantelor nu au specificitate de fixare deoarece nu pot adera la peretele celulozic al celulelor vegetale si nu-l pot strabate decat daca integritatea lui a fost afectata prin leziuni mecanice. De aceea infectarea plantelor necesita cantitati mari de virus; in schimb, o data produsa ea este insotita de o multiplicare virala foarte abundenta in celulele infectate.

Virusurile animale se fixeaza mult mai putin specific si mai putin eficient decat fagii. Dupa o serie de ciocniri intamplatoare ale virusului cu celula respective, rezultate din miscarea browniana, si dupa o faza de absorbtie nespecifica reversibila, urmeaza faza de de absorbtie specifica ireversibila. Stabilitatea absorbtiei specifice de pe suprafata virusului si de pe aceea a celulei cu care el a venit in contact. In conditiile favorabile de complementaritate geometrica si electrostatica, virusul si celula se leaga prin legaturi ionice van der Waals sau prin legaturi de H sufficient de puternice pentru a contracara fortele de dispersie. Dupa Allison Valentine, gruparile amino ale capsidei virale ar interactiona cu gruparile fosfat puternic acide ale suprafetei celulei-gazda.Rata fixarii(eficienta coliziunilor) observata frecvent este de 3-5x datorita faptului ca o particula virala trebuie probabil sa se loveasca de mai multe ori de o celula inainte de a se fixa specific pe ea.

In sfarsit, unele virusuri (virusul gripal) se fixeaza pe receptori celulari specificide natura glicoproteica, al caror grup prostetic reprezinta substratul de actiune al unei enzime virale (neuraminidaza) " distrugatoare de receptori", care favorizeaza infectia.Intrucat atat virusul cat si suprafata celulei sunt electronegative, este necesara prezenta cationilor care sa scada repulsia lor electrostatica.

Patrunderea virionilor in celula Dupa fixare, virusurile animale patrund intact in interiorul celulei-gazda printr-un proces activ de ingestie, denumit viropexie, care este analog celui de pinocitoza(procesul prin care celulele capteaza si inglobeaza picaturi de lichid prin invaginarea membranei celulare).Dupa ce contactul intim s-a realizat, membrane celulara " aluneca" pe suprafta virionului si formeaza o mica invaginare care se adanceste progresiv, iar apoi se stranguleaza ca un mugure.Virusul inchis in vacuola astfel rezultata este introdus pe aceasta cale in celula, in timp ce marginile opuse ramase libere ale membranei celulare invaginate fuzioneaza pentru a restabili integritatea suprafeti celulare.Virusul ramane inclus intr-o vezicula citoplasmica ai carei pereti se dezintegreaza eliberand virionul in celula.

Biochimia si cinetica replicarii virusurilor Acidul nucleic viral actioneaza in celula ca un material genetic strain, care contine toata informatia necesara pentru a dirija sinteza mai multori tipuri de componenti macromoleculari, asigurand in felul acesta propria sa replicare, formarea proteinelor structurale de capsida, a inhibitorilor biosintezelor celulare normale, a unor proteine care regleazactivitatile metabolice ale celulei infectate etc.In aceasta faza virusul se gaseste in celula sub forma de virusul vegetativ.

Dezvoltarea virusului in celula comporta 3 faze: a) replicarea informatiei genetice virale b) traducerea acestei informatii in sinteza de proteine virale c) morfogeneza virusului.

Replicarea genomului viral in celula gazda Penutru a-si exercita functia, genomul viral trebuie sa fie mai intai debarasat de invelisurile sale. La unele virusuri , acest process are loc simultan cu dezintegrarea membrane vacuolare, care izoleaza virusul de citoplasma. La altele, capsida este degradata chiar in vacuola, sub actiunea enzimelor proteolitice ale celulei, iar acidul nucleic viaral paraseste vacuola fara a-i rupe peretele, fiind gasit la aproximativ o ora de la infectie in matricea citoplasmica din vecinateatea nucleului. Soarta capsomelelor nu este cunoscuta, dar se crede ca, devenite nefunctionale, ele intra in metabolismul general al celulei.

Perioada in care acidul nuclei este liber, "nud", a fost descrisa ca o faza de disparitie a virusului infectios (faza de eclipsa). In realitate, este insa vorba numai de o schimbare de stare a virusului care il face mai greu de evidentiat. In aceasta faza virusul are o infectiozitate mica, deoarece acidul nuclei izolat are mai putine posibilitati de a initia infectia, in comparative cu virusul complet matur.

Urmeaza o perioada de aproximativ o ora in cursul careia AN"nud" ajunge la locul unde se vor replica enzimele implicate in sinteza AN si a proteinelor virale precum si la locul in care se acumuleaza energia necesara proceselor de replicare si sinteza.

In acest proces, la care virusul contribuie numai cu informatia sa genetica , celula gazda furnizeaza tot materialul general sintezelor codificate de genomul viral (aminoacizi , nucleotide), enzimele, ARNt si propriile sale sedii de sinteza(ribosomic), rpecum si energia necesara acestor sinteze; dependenta virusului fata de activitatea vitala a celulei sale gazda este, prin urmare totala, de unde parazitismul sau absolut.

Biosinteza proteinelor induse de virus Sub influenta genomului viral celula-gazda se formeaza doua categorii de proteine: precoce si tardive.

Proteinele precoce, esentiale pentru initierea replicarii genomului viral, sunt sintetizate in cea mai mare parte sub controlul genomului viral parental introdus prin infectie.In plus, functiile acestor proteine care actioneaza ca enzime sunt: a)inhibarea replicarii ADN,ARN, si a proteinelor specifice celulei gazda si b) cataliza sintezei unor proteine care constituie "matricea virala", adica spatial in care au loc replicarea, asamblarea si morfogeneza virusului,

Aceste enzime noi pot cataliza reactii foarte diferite de cele care au loc in celula-gazda, sau pot fi de tipul celor deja existente deja in celula neinfectata care difera de acestea prin anumite proprietati fizico-chimice.

Proteinele tardive apar in special sub influenta genomurilor virale progene, produs al replicarii virale in celula-gazda.Ele sunt proteine de structura(capsidele) si proteine de reglare care intrerup formarea enzimelor induse de virus si care asigura desfasurarea reactiilor legate de maturarea si eliberarea virusului din celula.

Replicarea genomului viral se face sub actiunea polimerazelor specifice virusului respectiv, fapt pus in evidenta de studiul cineticii acestiu process.Virusurile care contin un ARN monocatenar au o perioada de latenta mai scurta decat cele cu ARN sau ADN dublu catenare.De asemenea, timpul de dublare al numarului virionilor este mai scurt la virusurile cu ARN monocatenar.Aceasta se datoreaza in primul rand faptului ca genomul constand din ADN trebuie sa serveasca succesiv ca matrita pentru propria sa replicare si pentru formarea de ARN, specific viral, necasra pentru codificarea sintezei proteinelor,in timp ce genomul alcatuit din ARN poate exercitaa concomotent cele doua functii de matrite legate una de propria lui replicare si cealalta de sinteza proteinelor virale.In plus, replicarea unui genom mai complex cum este acela constituit din ADN dublu catenar,necesita o perioada mai lunga de timp.

Morfogeneza virionului La sfarsitul fazei de biosinteza, in care in celula-gazda se acumuleaza cantitati mari de acid nucleic si proteine virale, urmeaza faza de asamblare, de grupare a acestor componente pentru a forma structura organizata a particulei virale mature.

La virusurile mici, directiile de aranjare a materialului capsidei sunt determinate de insasi conformatia constituentilor lui, care se leaga intre ei spontan si formeaza o structura organizata printr-un process de autoasamblare. Pentrucele mai multe virusuri, maturarea nu implica participara unor enzime, deoarece intre AN si capsida se formeaza de obicei numai legaturi secundare slabe.

La virusurile mai complexe, procesul de asamblare este mai complicat si implica participarea unor gene morfogenetice printr-un proces care nu este cunoscut in detaliu. Virusurile cu invelis extern capata aceasta structura care se formeaza printr-o portiune a membranei celulare sau nucleare, in faza terminala a maturarii.

Sediul sintezei si maturarii virusurilor.Replicarea si morfogeneza virusurilor sunt procese intracelulare care au loc fie in nucleu fie in matricea citoplasmatica.Ribovirusurile se multiplica in citoplasma, cu cateva exceptii, cum ar fi, de exemplu, virusul gripal, la care nucleocapsida se formeaza in nucleu iar hamaglutininele in citoplasma.

VIRUSUL GRIPAL

  Virusurile cu ADN se replica in nucleul celulei, cu exceptia poxvirusului care se formeaza in citoplasma.La virusurile cu peplos, indiferent de natura acidului nucleic, formarea virusului se desavarseste catre periferia celulei, unde nucleoproteina virala este imbracata de un invelis lipoproteic derivate din membrana celulara.

Durata ciclului de desfasurare este mai mare la virusuri decat la bacterii si variaza intre 12 si 90 de minute pentru fagi, 4 ore pentru virusul gripal si 6 ore pentru virusul herpetic.

Liberarea din celula a particulelor virale progene Acest proces evolueaza deseori cu particularitati proprii diferitelor virusuri.

In timp ce virusurile ADN (cu exceptia virusului herpesului) tind sa fie retinute in celule chiar si dupa aparitia efctului citopatic si sunt de aceea eliberate cu frecventa mica sau moderata, virusurile cu ARN sunt liberate masiv.

Liberarea virusurilor se poate face rapid si explosive prin ruperi mecanice(in modul cel mai brutal la bacteriile infectate cu fagi, care practice explodeaza) sunt lent si controlat prin strabaterea membranei celulare a carei permeabilitate este marita in urma alterarilor produse de virus.In unele cazuri, virusul trece direct de la o celula la alta adiacenta; alteori, infectia unor cellule noi este conditionata de trecerea prealabila a virusurilor in afara celulei-gazda in care au produse. Mecanismul liberarii este de asemenea diferit. Poliovirusurile se acumuleaza in cantitati mari in citoplasma celulei-gazda care le elibereaza prin moartea ei brusca. Virusurile cu invelisuri lipoproteice asamblate catre suprafata celulei sunt liberate printr-un proces similar celui de "inmugurire". Herpevirusul si vaccina sunt inchise intr-o vezicula(cisterna ) derivate din reticulul endoplasmatic si transportate astfel spre suprafata celulei unde vin in contact cu membrana celulei. Printr-o deschizatura aparte in membrane celulara, virusul iese din celula invelit in membrana interna a cisternei. Ca urmare, dupa aproximativ 6 ore de la infectie incepe o liberare continua de virus care dureaza pana la degenerarea celulei infecatate(circa 10 ore).

VIRUSUL HERPETIC

a.    BiosintezaVMT

Dupa infectarea celulei-gazda, ARN viral se elibereaza din invelisul sau proteic, probabil in nucleul acesteia, sub forma unei molecule unice monocatenare. Dupa replicarea si acumularea lui in cantitati mari el trece din nucleu in citoplasma, unde are loc sinteza proteinelor virale sub forma unor molecule aproximativ elipsoidale, care tind sa se alipeasca si sa se agrege atunci cand se lovesc unele de altele. In prezenta ARN viral se realizeaza un process de asamblare care decurge ca o cocristalizare sau coagregare a doua specii moleculare compatibile, pentru a da nastere unor particule care devin progresiv mai stabile pe masura ce cresc, deoarece fiecare proteina se leaga de alte 6 molecule proteice vecine si de lantul de ARN din interiorul structurii in curs de constituire. Aceasta explica stabilitatea sporita a particulei astfel formate, in raport cu proteinele si ARN isolate.

Asamblarea subunitatiilor proteice se face automat si in vitro, de unde reiese ca forma virionului este dicatata integral de forma si afinitatiile de grupare ale proteinelor sale, morfogeneza fiind rezultatul unui process de aditie a unor subunitati identice asezate in pozitii identice. Dovada este faptul ca exista "virus exclusiv proteic" (fara ARN), care insa este nefunctional, adica neinfectios. Prezenta ARN asigura infectiozitatea, capacitatea de reproducere si in plus, determina marimea particulei virale.

b Replicarea ribovirusurilor animale

Replicarea virusurilor cu ARN constituie o problema unica in biologie, deoarece ofera singurul exemplu in care informatia genetica este codificata originar nu in ADN - depozitarul universal de informatie genetica - ci tot intr-o molecula de ARN inzestrata, ca si cea de ADN, cu capacitate de replicare. In cursul infectiei unei celule gazda, ARN viral indeplineste o dubla functie: a). actioneaza direct in procesul de biosinteza a proteinelor ca transportor al mesajului genetic furnizand informatia necesara pentru sinteza proteinelor structurale ale capsidei si a enzimei ARN - polimeraza; b). actioneaza ca model pentru sinteza a noi molecule de ARN sub actiunea acestei polimeraze. Studiile in aceasta problema s-au facut pe virusul polio virusul encefalomiocarditei etc. Dupa infectara celulei gazda si dezvelirea genomului din virion, ARN viral ramane liber in citoplasma. Titrul infectios al virusului(apreciat prin capacitatea celulelor infectate de a determina infectarea altor celule) scade foarte mult datorita acestei stari particulare in care se gaseste virusul (faza de eclipsa). In procesul de replicare, ARN viral actioneaza atat ca model pentru propria sa reproducere cat si ca ARNm pentru sinteza proteinelor specifice virale. Intr-o prima faza acest ARN " dezgolit" dirijeaza sinteza unor proteine cu actiune inhibitoare fata de metabolismul celular, precum si sinteza unei ARN - polimeraze corespunzatoare lui. Urmeaza sinteza ARN viral, care incepe dupa 30-45 minute de la infectie si continua exponential 3 ore, apoi, liniar, inca 2-3 ore. Sub influneta genomului poliovirusului (circa 6000 de nucleotide) in celula-gazda apar aproximativ 14 tipuri noi de proteine. Dintre acestea, 4 au rol structural, participand la formarea capsidei, iar celelalte, proteinele virus-specifice necapsidale - indeplinesc diferite functii ca: a). alterarea metabolismului normal al celulei gazda prin blocarea sintezei propriului ei ARN; b). blocarea sintezei proteinelor celulare normale; c). cataliza formarii unor cantitati mari de ARN viral. Proteina capsidala este sintetizata cu putin inainte de formarea virusului matur. In acest timp se acumuleaza in celula o cantitate mare de proteine virale, constand din aggregate polimerice de subunitati proteice(capsomere), care vor fi utilizate pentru formarea de virus matur sau se vor acumula simplu, ca atare, in celula. Sinteza acestor proteine are loc in citoplasma, la nivelul unor agregate de ribosomi(polisomi), care in celula infectata sunt mai mari decat in celula normala si sunt asociati de obicei cu structuri membranoase lipidice, avand rol de a separa sediul procesului infectious de restul citoplasmei.

Maturarea sau morfogeneza virusului ar fi un process spontan, care nu necesita energie, evoluand sub actiunea fortelor reprezentate de afinitatea chimica existenta intre proteinele capsidale si, in mai mica masura, intre acestea si ARN viral. El incepe dupa 2-3 ore de la infectie si continua apoi in ritm foarte rapid: sinteza unei molecule de ARN dureaza aproximativ 1 minut, iar dupa alte 2-3 minute el este incorporate in capsida. De altfel, numai 20-60% din ARN viral nou sintetizat este incorporate in particule de virus matur, in timp ce restul ramane in celula fie pentru a fi folosit ca model sau ca mesager, fie pentru ca pur si simplu nu poate fi incorporate. Dupa 6 ore de la infectie, incepe liberarea progresiva a virusului progen din celula-gazda ca rezultat al modificarilor ei patologice induse de virus.

c. Replicarea virusurilor cu ADN

Cinetica replicarii intracitoplasmice a virusului vaccinal. Dupa patrunderea virusului in celula prin viropexie, invelisul sau extern fosfolipidoproteic este rapid degradat, probabil sub actiunea unor factori preexistenti in celula infectata.

Replicarea ADN, care incepe dupa 30 de minute pana la 2 ore de la infectie, atinge un nivel maxim la aproximativ 90 de minute si se termina dupa 5 ore, are loc in zone sau incluziicitoplasmatice mari, adevarate 'fabrici' de virus. Dupa incheierea procesului de replicare, genomurile rezultate se asociaza ci proteina strucurala, astfel incat 6-6½ ore incep sa apara primele particule de virus matur.

Proteinele nou formate in celula infectata sunt elaborate in doua etape succesive sub actiunea unui ARNm specific viral. Mai intai se formeaza un ARNm 'precoce' , a carui sinteza se face dupa modelul oferit de genomulparental(ADN dezgolit' al virusurilor patrunse in celula prin infectie). Acest ARNm 'precoce' actioneaza in prima etapa de formare a proteinelor virale, si anume dirijeaza, intre altele, sinteza unei ADN-polimeraze, enzima implicata in replicarea ADN viral, deci in formarea unui numar mare de genomuri progene. La randul lor, genomurile virale progene servesc sa model pentru formarea unui ARNm 'tardiv'. Acesta codifica in primul rand formarea unei enzime care inactiveaza ARNm 'precoce' (la 3-4 ore de la infectie) si apoi declanseaza de-a doua etapa in sinteza proteinelor virale, aceea in care sunt elaborate subunitatile structurale, care vor alcatui capsida.

Maturarea virusului dureaza pana la 16-20 de ore de la infectie, cand ¹/₃-¹/₂ din moleculele progene de ADN sun inchise in particule mature de virus, iar celula contine circa 10 000 virioni dispersati in diferite regiuni ale citoplasmei.

Cinetica replicarii intranucleare a virusului herpesului. Timpul ecesar pentru replicarea unei molecule ADN viral este de aceasta data de maximum 40 de minute. Dupa cum s-a dovedit experimental, ADN viral se acumuleaza intr-un interva de 4-14 ore de la infectie, in vecinatatea unor agregate granulare, a caror periferie se observa corpusculi de aproximativ 100 A, care ar putea corespunde capsomerelor.

Primele particule de virus apar la 4 ore dupa infectie si ar fi 'nude', daica lipsite de peplos si neinfectioase sau slab infectioase. Dupa Falke, ele ar trece apoi din nucleu in citoplasma, antrenand cate o portiune din membrana nucleara care ar deveni astfel invelisul (peplosul) virionului matur infectios.

Dupa Epstein particulele de virus imatur 'nud', fara invelis, dispuse in nucleu sub forma de mase mari cristaline sau ca entitati individuale diseminate dezordonat, ar trece in citoplasma si s-ar acumula acolo in jurul unor vacuole citoplasmice care apartin probabil aparatului Golgic.Impingand membrana vacuolara, particula virala ar determina invaginarea 'in deget de manusa' a acesteia catre lumenul vacuolei, acoperindu-se astfel in intregime cu portiunea invaginata, dupa care s-ar detasa impreuna cu aceasta, cazand in cavitatea vacuolei sub forma de virus matur 'invelit'. Particulele virale care la iesire din nucleu au ajuns spre periferia celulei si-ar constitui peplosul pe seama membranei citoplasmatice. Cum membrana nucleara, membrana sistemului vacuolar alcatuind aparatul Golgi si membrana citoplasmatica apartin aceluias sistem anatomo-functional, este de presupus ca virusul sa poata folosi pe oricare dintre ele pentru formarea invelisului sau extern.

BIBLIOGRAFIE : G. ZORNEA

MICROBIOLOGIE GENERALA

EDITURA DIDACTICA SI PEDAGOGICA - BUCURESTI 1970

PROF. DOCTOR GHINEA LUCIAN

CURS DE BIOLOGIA SI MICROBIOLOGIA SOLULUI

EDITURA AROPRINT, TIMISOARA 2004