MICROORGANISMELE. DESCOPERIREA, ANATOMIA SI FIZIOLOGIA LOR

Obiective

Dupa studiul acestui capitol va trebui sa fiti in masura:

A defini microorganismele.

A descrie diversitatea lor.

A preciza principalele lor implicatii in activitatile umane in general si in practica medicala in special.

A enumera si descrie cele patru modalitati prin care le depistam si studiem.

A explica relatia intre clasificarea, numirea si identificarea lor.

A preciza etapele identificarii lor.

INTRODUCERE IN STUDIUL MICROBIOLOGIEI

DEFINITII

Microbiologia este o stiinta a naturii care studiaza microorganismele si activitatile lor. Microorganismele, numite si microbi sau germeni, sunt vie­tuitoare care, din cauza dimensiunilor foarte reduse, pot fi vazute numai prin microscoape.

Microbiologii cerceteaza forma, structura, nutritia, metabolismul, cres­terea, inmultirea microorganismelor si relatiile lor cu factorii fizici, chimici sau biologici ai mediului ambiant. Aceste studii sunt motivate de necesitatea influentarii si controlarii efectelor favorabile sau nocive pe care microorga­nismele le exercita asupra omului, animalelor sau plantelor.

SCURT ISTORIC AL MICROBIOLOGIEI

Olandezul Antonie van Leeuwenhoeck, un pasionat slefuitor de lentile, a observat si descris in anii 1670, cu ajutorul microscoapelor sale, fiinte mi­nuscule, necunoscute pana atunci, pe care le-a numit animalculi. Este prima semnalare a existentei microorganismelor. Leeuwenhoeck nu a putut de­monstra insa de unde si cum apareau animalculii in infuzia de piper, de fan sau in saliva in care i-a observat. Nici despre activitatile lor, exceptand mobi­litatea, nu a putut relata nimic, pentru ca nu existau inca metodele si tehni­cile adecvate pentru un studiu mai complet al microorganismelor.

Parintii microbiologiei sunt doi savanti, chimistul francez Louis Pasteur (1822-1895) si medicul german Robert Koch (1843- 1910), care au ar­gumentat experimental implicarea microorganismelor in variate procese fun­damentale pentru om si posibilitatea controlarii acestor procese. Asa au de­monstrat ca unele microorganisme cauzeaza boli transmisibile ale omului si animalelor, ca microbii care cauzeaza boli sunt diferiti de cei prezenti la per­soane normale sau in mediul ambiant. Louis Pasteur a mai demonstrat ca fer­mentatiile prin care se obtin vinul, berea sau otetul sunt determinate de anumite microorganisme si perturbate de altele. Pentru realizarea acestor lucruri cei doi savanti au trebuit sa elaboreze si sa perfectioneze o serie intreaga de metode si tehnici noi, dintre care retinem: antisepsia (omorarea microorga­nismelor de contaminare), asepsia (manipulare la adapost de contaminarea cu microorganisme), cultivarea microorganismelor si izolarea lor in culturi pure s.a.

La sfarsitul secolului al XlX-lea microbiologia era o stiinta in plina afirmare: erau deja identificate microorganismele care cauzeaza antraxul, lepra, febra puerperala, furunculele si supuratiile plagilor, erizipelul, holera, tuberculoza, difteria, pneumonia, meningita cerebro-spinala, pesta, dizen­teria.

1.1.3. IMPORTANTA MICROBIOLOGIEI SI LEGATURA EI CU CELELALTE DISCIPLINE MEDICALE

Microbiologia, stiinta experimentala, a aparut ca raspuns la necesita­tile economice si de sanatate impuse de dezvoltarea societatii din a doua ju­matate a secolului XIX. in Sudul Frantei industria traditionala a matasii era in criza din cauza unor boli ale viermilor de matase. Dezvoltarea industrii­lor vinului, alcoolului, otetului, berii era afectata de perturbarea proceselor de fermentatie. In turmele de animale dalacul (antraxul), facea ravagii. Boli contagioase ca difteria, holera, tuberculoza s.a. faceau ravagii in colec­tivitatile umane. Desi beneficiara a primelor tehnici de anestezie, chirurgia ajunsese in impas din cauza infectiilor post-operatorii: in Franta anilor 1860 mortalitatea dupa amputari era peste 60%. Febra puerperala facea ravagii in maternitati: 310 lehuze moarte la 1530 nasteri, in 1864 la maternitatea din Paris.

Convins, prin experiente proprii, de raspandirea larga a microorganis­melor in mediul ambiant si de rolul lor patogen, Louis Pasteur declara chirur­gilor: "Daca as avea onoarea sa fiu chirurg, patruns cum sunt de pericolele la care ne expun germenii microbieni, raspanditi pe suprafata tuturor obiec­telor din spitale, nu numai ca as respecta o curatenie perfecta, dar dupa ce mi-as spala mainile cu cea mai mare bagare de seama si dupa ce le-as supune unui flambaj rapid nu as intrebuinta decat vata, pansamente si bureti tinuti in prealabil la o temperatura de 130- 150°C si n-as folosi decat apa care a trecut printr-o temperatura de 110- 120°C'.

Iata ce ii scria lui Louis Pasteur in 1874 chirurgul englez Sir Joseph Lister (1827- 1913), primul care a aplicat intr-un serviciu de chirurgie prin­cipiile pasteuriene de asepsie si antisepsie: ,,Daca veti veni vreodata la Edinbourgh, va fi, cred, adevarata rasplata pentru Dumneavoastra sa vedeti in spitalul nostru in ce masura a profitat neamul omenesc de lucrarile Dumnea­voastra. Mai e nevoie sa adaug cat de mare mi-ar fi multumirea dea va arata aici cat va datoreaza chirurgia. Intr-adevar in serviciul lui Lister, inca in anii 1867- 1868, din 40 amputati au fost salvati de la moarte 34.

Semnificativ, denumirea de microb a fost utilizata prima data in 1878 de nu chirurg, Sèdillot, la Academia de Stiinte din Paris in comunicarea intitulata "Despre influenta descoperirilor Domnului Pasteur asupra progreselor din chirurgie'.

Robert Koch a sesizat legatura cauzala dintre microorganisme si leziuni in cursul bolilor infectioase Elevi ai sai au continuat studiul. Victor Babes (1854-1926), medic roman, de formatie anatomopatolog, cu studii la Buda­pesta, Viena, Berlin si Paris, si-a insusit tehnicile de microbiologie si a studiat morfopatologia interactiunii dintre microbi si organismul infectat. Aceasta i-a dat prilejul sa colaboreze la primul tratat de bacteriologie din lume: ,,I.es bactéries et leur rôle dans l'etiologie, l'anatomie et l'histologie pathologiques des maladies infectieuses', A. V. Cornil et V. Babes, ed. Felix Alcan, 1885, Paris.

Colaboratorii si elevii lui Pasteur au continuat si aprofundat studiul agresiunii microbiene asupra organismului animal. Ilia Mecinikov (1845-1916) a descoperit fagocitoza si rolul inflamatiei in apararea antimicrobiana, iar Charles Richet anticorpii. In acest fel microbiologii sunt cei care au creat premisele imunologiei. Elev si colaborator al lui Mecinikov in Institutul Pas­teur din Paris a fost medicul si biologul roman Ion Cantacuzino (1863-1936). La intoarcerea in tara, I. Cantacuzino a creat o scoala de microbiologie pe care a dezvoltat-o in Institutul de Cercetari Microbiologice care ii poarta astazi numele.

Aparitia microbiologiei a marcat o epoca in dezvoltarea medicinei, ,,epoca pasteuriana', caracterizata prin: . dezvoltarea fara precedent a chi­rurgiei, devenita beneficiara a metodelor si tehnicilor de asepsie si antisepsie prin care a fost stapanita infectia post-operatorie; . combaterea si profi­laxia eficienta a bolilor contagioase.

Utilizarea de catre Paul Ehrlich (1854-1915), elevul lui Robert Koch, a Salvarsanului, un compus arsenical, pentru terapia sifilisului, descoperirea sulfamidelor in 1935 de catre chimistul german Gerhard Domagk si utili­zarea lor cu succes in tratamentul unor boli infectioase grave, descoperirea penicilinei in 1928 de catre Sir Alexander Fleming si prepararea ei ca medi­cament antimicrobian in 1941 de catre Sir Howard Florey si Sir Ernst Chain au deschis epoca chimioterapiei antimicrobiene.

Microorganismele au o structura atat de simpla si accesibila analizei chimice incat microbiologii au putut stabili corelatii semnificative intre mo­dificari ale acizilor nucleici si structurile si functiile microbiene. Astfel in anii '40, prin experimentele lui Oswald Avery, Colin Mac Leod si Maclyn Mc Carty, microorganismele deveneau obiect de studiu pentru genetica, pre­misa pentru dezvoltarea geneticii moleculare

In medicina contemporana microbiologia, imunologia si genetica mole­culara isi aduc o contributie substantiala la dezvoltarea oncologiei prin eluci­dari importante in etiopatogenia cancerului.

METODE DE DEPISTARE SI PROPRIETATI PRINCIPALE ALE MICROORGANISMELOR

1.2.1. METODE DE STUDIU AL MICROORGANISMELOR

Exista patru metode pentru depistarea si studiul microorganismelor:

Microscopia, care permite analiza morfologiei si structurilor.

Cultivarea, care permite sa le izolam, apoi sa le replicam in culturi pure pentru identificare.

Inocularea la un animal care permite izolarea sau /si identificarea lor.

Reactiile antigen-anticorp in care microorganismul de studiat sau un extract al acestuia constituie antigenul necunoscut depistat si identificat daca reactioneaza, specific cu anticorpul dintr-un anumit ser imun preparat pe animal.

Aceste metode de studiu nu se exclud, ci se completeaza reciproc. Pen­tru depistarea si identificarea unor microorganisme le folosim pe toate patru. Mai frecvent recurgem la microscopie si cultivare completate, dupa caz, cu identificarea antigenica. Dar sunt cazuri in care este suficienta numai culti­varea, numai microscopia sau numai identificarea antigenica.

1.2.2. DIVERSITATEA MICROORGANISMELOR: DIMENSIUNI, MORFOLOGIE, STRUCTURA, PROPRIETATI

Lumea microorganismelor, foarte diversa, reuneste organisme celulare, cu diferite grade de evolutie: bacterii, fungi, protozoare, si organisme acelulare: virusurile.

Microorganismele celulare poseda toate cele trei atribute definitorii ale vietii:

au metabolism energetic: prin sisteme enzimatice proprii obtin, din­tr-un anumit substrat, energia necesara proceselor vitale (biosinteze, crestere, inmultire, mobilitate s.a.);

au metabolism de sinteza: isi realizeaza biosinteza enzimelor, protei­nelor si altor structuri celulare;

au informatia genetica pentru structurarea enzimelor si proteinelor proprii. Aceasta informatie genetica este codificata in molecule de acid dezoxiribonucleic (ADN) si este transmisa:

aparatului de biosinteza din citoplasma (ribozomii), pe de o parte;

urmasilor, prin diviziune, pe de alta parte;

Bacteriile au dimensiuni cuprinse intre 1 si 10 m si sunt curent obser­vate si studiate cu microscopul optic (fig. 1-1). La exterior au un invelis rezistent si rigid, peretele bacterian, care le confera o anumita forma. For­mele de baza ale bacteriilor sunt: sferica, de bastonas, filamentoasa, rigida si ramificata sau filamentoasa, flexuasa si spiralata. In afara de forma, mor­fologia bacteriilor mai este definita si prin asezarea celulelor (fig. 1-2).

Bacteriile sferice sunt numite coci. Ele au aproximativ 1 m in dia­metru. Cocii care se asaza in gramezi neregulate, ca ciorchinii de struguri, se numesc stafilococi. Cei care se ataseaza unul la altul formand lanturi ii numim streptococi. Restul cocilor se ataseaza unii la altii in perechi, fiind numiti diplococi. Asa sunt: pneumococii, meningococii si gonococii. Unii coci sunt per­fect sferici (stafilococii, streptococii), altii sunt ovali sau lanceolati (pneumo­cocii) sau reniformi (meningococii sau gonococii).

Bacteriile in forma de bastonas le numim bacili. Dimensiunile bacililor variaza foarte mult. Cei mai mici, cum sunt cei care cauzeaza tusea convul­siva, aspectul unor coci alungiti si, ca atare, sunt numiti cocobacili. Bacilii tuberculozei sunt bastonase subtiri, bacilii difterici au capetele maciucate, iar cei care cauzeaza antraxul sunt mari , au capetele retezate drept si se dispun in lanturi.­

Fig. 1-1. Dimensiunile relative ale microorganismelor si altor agenti infectiosi descrisi in acest manual.

Bacilii incurbati sunt numiti vibrioni. Asa este vibrionul care cauzeaza holera.

Bacterii filamentoase, rigide si ramificate sunt actinomicetele numite asa pentru asemanarea lor cu fungii (micetele) - vezi mai jos.

Bacterii filamentoase, flexibile si spiralate sunt spirochelele, organisme atat de subtiri incat pentru a fi observate trebuie examinate la microscopul cu fond negru sau prin coloratii speciale. Numarul spirelor si forma lor va­riaza mult. Boreliile, care cauzeaza febra recurenta, sunt mai mari, au spire putine, adanci si neregulate. Leptospirele, care cauzeaza icterul spirochetozic, sunt foarte subtiri, au spire numeroase, putin adanci si foarte stranse, incat dau organismului aspectul de franghie rasucita. Treponemele, cum este cea care cauzeaza sifilisul, sunt spirochete fine cu un numar mediu de spire, adanci si regulate (v. fig. 1-2).

Fig. 1-2. Formele de baza si asezarea bacteriilor. O diviziune pe latura stanga a diagramei reprezinta 1 µm.

Singurele bacterii lipsite de perete celular sunt micoplasmele. Din aceasta cauza sunt foarte polimorfe si au dimensiuni reduse forme cocoide de 0.125-0.250 m; forme filamentoase ramificate.

Unele bacterii, cum sunt pneumococii s.a, in mediul lor natural de viata apar inconjurate cu o capsula transparenta, dispusa la exteriorul peretelui bacterian (fig. 1-3).

Fig. 1-3. O bacterie capsulata pneumococul. Coloratie negativa cu tus de India. Observati capsula ca un halou clar in jurul corpilor bacterieni pe fondul negru al preparatului (dupa J.P Duguid, 1951).

Flagelii, organite cu aspectul firelor de par, lungi, subtiri, flexuase atasate la membrana citoplasmatica, confera mobilitate bacteriilor. Pot fi observati la microscopul optic numai prin coloratii speciale. Sunt prezenti la numeroase specii de bacili. La enterobacteriacee flagelii sunt dispusi peritrich, adica de jur imprejurul bacilului, la vibrionii holerici sunt unici cu dispozitie polara.

Spirochetele sunt foarte mobile gratie unor fibre axiale, analoage flagelilor, dar care nu apar la exterior fiind cuprinse in grosimea peretelui bacterian.

Pilii bacterieni, numiti si fimbrii, sunt organite filiforme, rigide, mai scurte si mai subtiri decat flagelii, prezente la diferite bacterii in mediile lor naturale de viata. Pot fi observati numai la microscopul electronic. Cel mai frecvent sunt dispusi peritrich. Prin pili bacteriile adera la receptori specifici de pe suprafetele celulare, ceea ce impiedica "spalarea' lor de pe suprafata mucoaselor si favorizeaza acapararea substantelor nutritive de la aceste ni­veluri (fig. 1-4).

Fig. 1-4. Organite bacteriene filiforme, electronomicrografii. A. Un bacil cu flageli peritrichi (X9 000). Observati lungimea si aspectul flexuos al flagelilor (dupa A. Houwink si W. van Iterson, 1950). B. Un bacil fimbriat (X24 000). Observati dispozitia peritricha, dimensiunile mai reduse si aspectul rigid al fimbriilor (dupa J.P. Duguid si J.F. Wilkinson, 1961).

Mai multi bacili, cum sunt cei responsabili de boli grave ca tetanosul, gangrena gazoasa, botulismul sau antraxul, formeaza spori care au aspectui unor corpusculi transparenti, sferici sau ovali, dispusi cate unul singur in centrul sau spre extremitatea bacililor (v. fig. 1-2). Aceste specii de bacili au doua forme alternative de existenta: forma vegetativa si forma sporulata Cat timp au la dispozitie apa, nutrienti si o temperatura adecvata pentru cres­tere, ele persista in forma vegetativa exact ca si speciile nesporogene. Cand nutrientii devin deficitari sau temperatura creste peste cea optima, este de­clansata sporogeneza (fig. 1-5). Sporii bactereni sunt forme de rezistenta in conditii adverse de mediu. Au un continut scazut in apa si invelisuri groase impermeabile la substante antimicrobiene, radiatii. Unii spori supravietu­iesc cateva ore la fierbere. In conditii de uscaciune sporii supravietuiesc multi ani, iar cand ajung in conditii favorabile de mediu (prezenta apei si nutrien­ti lor) germineaza: invelisurile sporale se rup si bacteria rehidratata isi reia viata activa in forma vegetativa (fig. 1-6).

Fig. 1-5. Un bacil care a sporulat, electronomicrografie (X33 000). Observati invelisurile groase multiple care asigura rezistenta sporului in conditii defavorabile de mediu ( dupa R.Y. Stanier, M. Doudoroff si E.A. Adelberg, 1963).

Fig. 1-6. Un bacil care a germinat din sporul sau, electronomicrografie (dupa G. Knaysi, R. Baker si J. Hillier, 1947 ).

Fungii sau micetele sunt un grup numeros de microorganisme mult mai mari decat bacteriile si cu structura celulara evoluata, asemanatoare ce­lulelor animale sau vegetale.

Cei mai simpli fungi sunt levurile: celule cu forma mai frecvent ovala si dimensiuni medii de la 3 la 6 µm care prin inmugurire formeaza celule fiice numite blastospori. Levuri sunt Candida albicans organinismul care cauzeaza bolile numite candidoze (margaritarelul ) sau speciile de Saccharomyces care asigura dospirea aluatului in panificatie sau fermentatia unor bauturi.

Majoritatea fungiilor sunt fungi filamentosi. Cresc sub forma de hife, formatiuni tubulare cu perete gros, frecvent septate, in care este continuta o masa citoplasmica continua multinucleata.

Prin crestere si ramificare hifele se intretes intr-o structura numita miceliu formatiune cunoscuta celor care au observat cu atentie cum se intinde mucegaiul (fig. 1-7, a). Levurile pot forma pseudohife cand celulele fiice se alungesc si raman inlantuite (fig. 1-7, b).

Fig. 1-7. Fungi. A. Un miceliu cu hife septate. Pe detaliul din cartus observati ca septurile sunt incomplete si un por central asigura continuitatea masei citoplasmice. B. O levura. Observati celulele ovale inmugurite (blastospori) si celule alungite care raman inlantuite in pseudohife (X 1000).

Fungii produc variate tipuri de spori. Spre deosebire de sporii bacterieni (cu functie de rezistenta numai), sporii fungici sunt forme de inmultire, de propagare si, unii din ei, au sporii fungici prevazuti cu perete gros impermeabil: artrosporii, chlamidosporii, conidiile (fig. 1-8). Acestia in conditii favorabile de mediu germineaza formand hife sau levuri.

Fig. 1-8. Spori fungici. A. Levura cu pseudohife, blastospori ovali inmuguriti intercelular si chlamidospori sferici la extremitatea libera a celulelor. B. Un miceliu in care prin segmentarea hifelor au aparut artrospori alternand cu celule goale. C. Conidii cu conidiospori. Observati peretele gros care asigura rezistenta chlamidosporilor, artrosporilor si conidiosporilor.

Protozoarele sunt microorganisme unicelulare mai mari decat bacteriile (v. fig. 1) si cu structura mai evoluata asemanatoare celulelor ani­male. Majoritatea sunt mobile gratie unor variate structuri: pseudopode, flageli, cili. Prezinta o forma de viata activa, la care ne referim cu numele generic de trofozoit, si o forma de rezistenta cu viata latenta, chistii (fig. 1-9).

Fig. 1-9. Un protozoar Balantidium coli. stanga trofozoidul. Dreapta chistul. Observati complexitatea structurala, comparativ cu bacteriile, si peretele gros care asigura rezistenta chistului in mediul extern.

Inmultirea. In conditii favorabile (prezenta apei, a nutrientilor, temperatura optima s.a.) microorganismele, la fel cu alte vietuitoare, se inmultesc pentru perpetuarea speciilor. Celulele lor cresc si, cand ating un anumit vo­lum, se divid, inmuguresc sau se fragmenteaza in mai multe celule.

Bacteriile se inmultesc in principal prin diviziune. Curand dupa ce bacteria in crestere ajunge la volumul critic, membrana citoplasmica si peretele se invagineaza formand septul de diviziune care se dezvolta spre centrul ce­lulei. Pozitia septului de diviziune este ecuatoriala la coci si perpendiculara pe axul lung al bacililor, vibrionilor sau spirochetelor (fig. 1-10). Bacteriile fiice, separate prin septul de diviziune , se despart sau raman atasate una de alta. Pozitiile succesive ale planului de diviziune si numarul de generatii, cat raman atasate una de alta bacteriile fiice, determina asezarile lor caracteristice (v. fig. 1-2).

Fig. 1-10. Stadiile succesive ale inmultirii bacteriilor prin diviziune.

Initial mai mici decat celula mama, bacteriile fiice cresc repede si se divid la randul lor. In conditii fizico- chimice si de nutritie optime bacilii coliformi se divid la intervale de 20 de minute, in schimb bacilii tuberculozei abia la intervale de cateva zile.

Prin diviziune se inmultesc si protozoarele.

Fungii se inmultesc in mod diferit: prin inmugurirea levurilor sau hifelor, prin fragmentarea hifelor sau prin formarea a numerosi spori (fig. 1-11). Prin inmugurire si fragmentarea formelor filamentoase se inmultesc si unele bacteriicum sunt actinomicetele sau micoplasmele.

Fig. 1-11. Stadiile succesive ale inmultirii fungilor si actinomicetelor. A. Inmugurirea unei levuri cu formare de blastospori. B, C. Inmugurirea si fregmentarea hifei unui fung si respectiv a pseudohifei unui actinomicet

Microorganismele acelulare, virusurile, poseda numai unul din atributele vietii informatia genetica codificata intr-o singura molecula de acid nucleic adapostita intr-un simplu invelis proteic invelis proteic completat, la unele virusuri, cu un invelis lipoproteic (fig. 1-12). Virusurile nu se divid, ci, pe baza infor­matiei genetice pe care o poseda, sunt replicate in copii identice de catre apa-ratul de biosinteza al unor celule pe care le paraziteaza obligatoriu. In afara celulei gazda virusurile sunt particule inerte numite virioni (fig. 1-13).

Fig. 1-12. Virusuri, electronomicrografii ale preparatelor colorate negativ. Stanga Adenovirus, un virus nud; A- electronomicrografia; B- modelul virionului format din sferule care sugereaza capsomerele capsidei (invelisul proteic). Dreapta Virusul gripal, un virus cu invelis lipoproteic; C- electronomicrografia; D- diagrama care sugereaza structura virionului.

Virusurile sunt cele mai mici microorganisme; nu pot fi vazute cu microscopul optic. Dimensiunile si forma virionilor pot fi determinate prin microscopul electronic. Cele mai mici sunt enterovirusurile (virusul poliomielitei s.a.) ai caror virioni sferici au diametrul aproximativ de 30 nm. Mai mari sunt virusurile gripale, tot sferice, cu diametrul de cea 110 nm. Cele mai mari sunt poxvirusurile (virusul variolei, v. vaccinei s.a.) ai caror virioni in forma de caramida au cca 400 nm lungime (v. fig. 1-13).

Fig. 1-13. Stadiile succesive ale replicarii unui virus de catre celula pe care o paraziteaza.

1.2.3. CULTIVAREA MICROORGANISMELOR

Necesitatea cultivarii

Uneori microorganismele prezente in produse patologice de la pacienti cu boli infectioase (puroi, lichid cefalorahidian s.a.) sau in probe de mediu (apa, alimente s.a.) nu pot fi observate, fie ca sunt in numar prea mic, fie sunt prea mici pentru a putea fi vazute la microscopul optic uzual. De ex., bacteriile, pentru a putea fi observate la microscop, trebuie sa fie prezente in concentratii de cel putin 10 000/ml sau gram de produs examinat. Dar chiar cand sunt in numar suficient pentru a putea fi observate, de multe ori, mai aleg in cazul bacteriilor si fungilor, microscopul nu poate preciza, numai pe baza aspectului lor, care dintre microorganismele observate sunt patogene si care nepatogene.

Inmultirea microorganismelor prin cultivare in laborator este o metoda de depistare mai sensibila decat microscopia si permite un studiu mai aprofundat al caracterelor acestor organisme necesare identificarii.

Cultivarea bacteriilor, fungilor si unor protozoare

Aceste microorganisme se reproduc cand sunt insamantate (depuse) si incubate (mentinute) pe suprafata sau in profunzimea unor solutii care asi­gura nutrienti sau alimente si conditii fizico-chimice necesare cresterii si multiplicarii cat mai asemanatoare celor din mediile lor naturale de viata. Ase­menea solutii le numim medii de cultura.

Conditiile de baza ale unui mediu de cultura

. Sa fie nutritiv. Nutrientii sunt substante ale caror solutii pot traversa direct membrana citoplasmica pentru a fi antrenate in reactii meta­bolice (aminoacizi, monozaharide, acizi grasi). In mediile naturale de viata microorganismele dispun pentru nutritie, cel mai frecvent, de alimente (pro­teine, polizaharide, lipide), material crud din care deriva prin digestie nutrientii. Pentru cultivarea microorganismelor patogene mediile de cultura trebuiesa contina proteine, zaharuri, lipide si vitamine similare celor din tesuturile si umorile noastre. De aceea la baza mediilor pentru cultivarea bacteriilor patogene sta extractul de carne completat cu peptone, produsi de digestie enzimatica (peptica sau triptica) a proteinelor din carne.

. Sa asigure presiunea osmotica si pH-ul similare celor din mediul intern al animalelor. Izotonia se asigura prin adaos de clorura de sodiu, iar pH-ul este corectat si mentinut la neutralitate ( pH = 7,0) prin sisteme tampon.

Sa fie steril (lipsit de microorganisme) pentru a cultiva exclusiv microorganismele din produsul investigat.

Sa fie transparent pentru a urmari facil aparitia culturii (vezi mai jos).

. Sa permita separarea, unele de altele, a microorganismelor dintr-un produs microbian (vezi mai jos medii lichide versus medii solide).

Totalitatea microorganismelor acumulate prin multiplicare intr-un mediu o numim cultura. Cultura pura este formata din microorganisme de acelasi fel si este necesara pentru identificarea corecta a microorganismelor.

Medii de cultura uzuale. Cel mai simplu mediu de cultura este bulionul nutritiv un mediu lichid care contine in solutie proteine si alte substante ex­trase din carne. Organismele care cultiva in bulion nutritiv tulbura mediul cu sau fara formare de depozit la fundul tubului. In mediile lichide descen­dentii microorganismelor se amesteca unii cu altii, ceea ce nu permite obti­nerea de culturi pure decat din produse care contin acelasi fel de organisme (monomicrobiene).

Prin gelificarea bulionului cu agar, o substanta gelatinoasa extrasa din alge marine, se obtine agarul nutritiv Acest mediu solid poate fi repartizat in tuburi ca panta de agar sau in recipiente cu suprafata mare, numite cutii Petri, ca placi de agar (fig. 1-14). Bacteriile si fungii, dupa epuizare pe supra­fata mediului solid si incubare corespunzatoare, cresc sub forma de colonii. O colonie se formeaza prin aglomerarea descendentilor unei singure celule sau grup de celule si este vizibila cu ochiul liber pe suprafata mediului solid (fig. 1-15). Deci o colonie reprezinta o cultura pura a microorganismului studiat. Epuizarea produsului microbian pe o placa cu agar permite obtinerea de culturi pure din produse polimicrobiene.

Fig. 1-14. Medii de cultura pentru bacterii. De la stanga la dreapta o placa cu agar nutritiv, un tub cu panta de agar nutritiv, un tub cu agar in coloana si panta, un tub cu coloana de agar moale, o placa cu agar- sange.

Fig. 1-15. Metoda uzuala de izolare a bacteriilor este epuizarea inoculului cu ansa pe suprafata unei placi cu agar nutritiv. A. Striurile de epuizare. B. Dispersia coloniilor aparute dupa incubarea culturii.

Multe microorganisme patogene nu pot cultiva pe mediile simple. Pen­tru cultivarea acestor organisme pretentioase sunt necesare medii imbogatite prin adaos de sange, de glucoza si unele vitamine la bulionul sau agarul nu­tritiv.

Medii speciale. Izolarea pe mediile de cultura uzuale a unui anumit microorganism din produse plurimicrobiene (de ex., materii fecale) poate fi dificila si uneori imposibila din mai multe motive:

- poate fi un organism fragil care moare ca urmare a expunerii la factori de mediu (uscaciune, oxidare, lumina, concurenta altor microorganisme) in intervalul dintre prelevarea probelor si insamantare;

- microorganismul urmarit este in cantitate foarte redusa fata de or­ganismele asociate;

- coloniile sale sunt indistincte de ale altor organisme asociate. Pentru asemenea situatii folosim mediile speciale.

Mediile de transport sunt medii lichide sau semigelificate care asigura supravietuirea microorganismelor fragile pana in momentul insamantarii probelor.

Mediile de imbogatire sunt medii lichide care favorizeaza inmultirea anumitor microorganisme si inhiba dezvoltarea organismelor asociate. Insamantarea si incubarea in aceste medii este utila ca etapa premergatoare epui­zarii pe medii selective pentru izolarea unui organism care se afla in numar redus intr-un produs polimicrobian.

Mediile diferentiale. Sunt medii agarizate care contin substratul pentru o enzima microbiana caracteristica si un indicator care evidentiaza atacarea acestui substrat, deci un caracter metabolic diferentiaza intre ele organisme cu colonii identice pe mediile de cultura uzuale. De ex., agarul nutritiv cu albastru de bromtimol lactozat diferentiaza enterobacteriaceele lactozo-pozitive de cele lactozo-negative.

Mediile selective contin substante cu efect antimicrobian asupra microorganismelor asociate, dar fara efect asupra celor a caror izolare o urmarim (de ex. unele antibiotice). Pentru a facilita reperarea coloniilor cu interes, mediile selective pot avea si caracter diferential.

Alte medii speciale de culttira sunt mediile de identificare Acestea contin substratul activitatii unei enzime microbiene si un indicator adecvat care evidentiaza modificarea substratului in cursul cultivarii bacteriei cercetate.

Insamantarea si incubarea culturilor

Pentru insamantari folosim ansa confectionata din sarma inoxidabila de platina sau crom-nichel. Uzual recurgem la epuizarea produsului microbian prin pliuri succesive pe suprafata unei placi cu mediu agarizat (fig. 1-15). Obtinerea de culturi pure si studiul acestora impun repicari , adica reinsamantarea pe un nou mediu de cultura (de ex. o panta de agar nutritiv, medii de identificare ).

Mediile de cultura insamantate sunt incubate adica mentinute in conditii necesare dezvoltarii culturii. Majoritatea speciilor bacteriene si unii fungi au crestere rapida cultura apare dupa 18 - 24 de ore incubare la temperatura opti­ma de dezvoltare (mai frecvent 37°C). Unele bacterii si multi fungi au crestere lenta perioada de incubare variaza de la cateva zile la cateva saptamani.

Temperatura constanta de incubare este asigurata in termostat: incinta termoizolata prevazuta cu sursa de incalzire electrica si sistem termoregulator.

Unele bacterii, fungii, protozoarele au nevoie pentru cultivare de oxi­gen si trebuie incubate in prezenta aerului. Incubarea anaeroba este indis­pensabila bacteriilor strict anaerobe. Indepartarea oxigenului si prezervarea culturii de contact cu aerul se obtine prin:

adaugarea la mediile de cultura a unor ingrediente cu activitate reducatoare (acid thioglicolic, glucoza, carne uscata) ;

fierberea timp de 20 minute a mediilor repartizate in coloana inalta si insamantarea dupa racire la 40°C asigura indepartarea oxigenului solvit in mediu si un contact redus cu aerul;

incubarea culturii in anaerostate recipiente speciale etanse, din care aerul poate fi indepartat si inlocuit cu hidrogen.

Bacterii necultivabile Cateva bacterii patogene au devenit atat de dependente de tesuturile omului si animalelor incat nu pot fi cultivate in laborator pe medii artificiale. Asa sunt rickettsiile, chlamidiile, treponema sifilisului, bacilul leprei. Rickettsiile si chlamidiile organisme cu dimensiuni foarte reduse, pot cultiva, ca si virusurile, numai in celule vii (vezi mai jos).

Cultivarea virusurilor

Lipsite de sisteme enzimatice pentru producerea de energie sau pentru sinteza proteica, virusurile nu pot cultiva pe medii artificiale. Ele cultiva numai in celule receptive capabile sa le replice conform informatiei genetice aduse de virion (v. fig. 1- 13). Se folosesc embrioni de gaina, culturi de celule si, in mai mica masura astazi, animale de laborator receptive.

Embrionii de gaina. In ouale fertile incubate la 35 - 37°C embrionul de gaina se dezvolta rapid, incat puii eclozeaza in ziua 21. Tesuturile em­brionilor in varsta de 6-14 zile, ca si membranele embrionare, permit cul­tivarea virusurilor, rickettsiilor si chlamidiilor. Pentru aceasta embrionii tre­buie inoculati (fig. 1-16), apoi incubati 3-5 zile la 37°C si sacrificati pentru prelevarea tesuturilor sau umorilor in care s-au acumulat microorganismele cultivate. Replicarea virusului in embrion determina: . moartea acestuia, . aparitia de leziuni (pustule, numite in limba engleza pocks, de unde de­numirea unei intregi familii de virusuri care determina asemenea leziuni: poxvirusuri) (fig. 1-17); . acumulare in lichidul alantoic sau amniotic de virioni sau componente virale care aglutineaza hematiile (hemaglutinine).

Fig. 1-16. Embrionul de gaina si caile de inoculare pentru cultivarea virusurilor, chlamidiilor si rickettsiilor

Fig. 1-17. Leziuni produse prin replicarea poxvirusurilor in celulele membranei chorio- alantoide a embrionului de gaina. A. Virusul variolei produce pocks-uri mici. B. Virusul vaccinei produce pocks-uri mari.

Culturile de celule Celule provenite din tesuturi umane sau animale normale (amnios uman, rinichi de maimuta, embrioni de gaina s.a.) sau tu­morile, plasate in solutii continand toate sarurile, vitaminele, aminoacizii s.a, necesari pentru supravietuire, crestere si diviziune, formeaza pe peretii recipientului de sticla un film celular continuu in care pot fi cultivate virusuri. Replicarea virusului in cultura de celule determina . efect citopatic (degenerarea celulelor), care poate fi urmarit microscopic (fig. 1-18); . aparitia in mediul supernatant de hemaglutinina virala; . aparitia de incluziuni virale acumulari paracristaline de virioni sau componente virale in aria de replicare si asamblare a virusului (citoplasma sau nucleu) (fig. 1-19). Cultivarea virusurilor in culturi de celule are un mare randament, incat metoda este folosita nu numai pentru diagnosticul infectiilor virale prin izolare de virus, ci si la producerea unor virusuri in cantitati mari pentru preparare de vaccinuri.

Fig. 1-18. Cultura de celule inoculata cu virusul poliomelitei. Observatii A- cultura la momentul inocularii, un film celular continuu; B si C- grade diferite ale efectului citopatic determinat de replicarea virusului de catre celulele infectate; celulele se rotunjesc si se desprind de pe suport.

Fig. 1-19. Incluzie intranucleara determinata de replicarea adenovirusului intr-o cultura de celule. Observati ca celula din centru, indicata de sageata, are nucleul marit de volum si contine o incluzie virala intens colorata (dupa J.M. Hoskins, 1967).

Animalele de laborator electiv receptive. Metoda este brutala, cruda tot mai putin folosita pentru izolare de virus. Replicarea virusului este demon­strata prin: . boala manifesta a animalului, eventual cu deces; . urma­rirea virusului in organe prin depistarea de incluzii virale, hemaglutinare s.a.

1.2.4. DIFERENTIEREA MICROORGANISMELOR: CLASIFI­CARE, NUMIRE, IDENTIFICARE

Diversitatea microorganismelor si a implicarii lor in bolile infectioase sau in diferite alte procese cu interes pentru om (degradarea alimentelor, procese industriale, fertilitatea solului) impune diferentierea tot mai precisa a acestor organisme.

Vorbind despre lucrurile si fiintele inconjuratoare le dam un nume, nu le descriem cu ansamblul caracterelor lor. Pentru aceasta, omul a comparat obiectele sau fiintele si le-a reunit pe cele asemanatoare in grupe (unitati) pe care le-a aranjat intr-o anumita ordine a asemanarilor (clasificat) si le-a marcat (numit). In raport cu acest sistem de unitati marcate el poate, prin comparatie, sa identifice un obiect sau un individ intalnit.

Clasificarea microorganismelor Oarecum asemanator procedeaza si microbiologii, dar unitatile de clasificare a vietuitoarelor reunesc indivizi asemanatori in virtutea descendentei dintr-un stramos comun, deci posesori ai unei informatii genetice comune. Unitatea de clasificare a vietuitoarelor este specia. Speciile care descind dintr-un stramos comun sunt reunite intr-un gen genurile in familii s.a.m.d.

Numirea stiintifica a microbilor se face prin nume latinizate. Se por­neste de la un substantiv grec sau latin, care defineste cel mai evident carac­ter al microorganismelor reunite intr-o unitate de clasificare si primeste un anumit sufix latin. De ex., familiile primesc sufixul aceae (ca Enterobacteriaceae - cf. s. gr. enteron = intestin; bacterii care traiesc in intestin). Ge­nurile primesc sufixele um (Clostridium - cf. s. gr. closter fus; bacterii in forma de fus mic), -us Staphylococcus - cf. s. gr. staphyle = ciorchine de strugure; s. gr. coccus = bob sau ou de peste; coci ca strugurii) s.a.m.d. Speciile sunt desemnate prin doua nume latine: al genului, care se scrie cu majuscula, urmat de un adjectiv, care caracterizeaza specia si se scrie cu litera mica (de ex., Clostridium tetani clostridia tetanosului, care cauzeaza boala numita tetanos). Denumirea stiintifica a microorganismelor se scrie cu carac­tere italice. Cand intr-un text numele genului se repeta, repetarile pot fi pre­scurtate. De ex., Staphylococcus aureus S. epidermidis Microbii mai frecvent intalniti au, in afara denumirii stiintifice, si denumiri comune. De ex., Neisseria gononhoeae - gonococ.

Identificarea unui microb izolat in cultura pura se face prin studierea in etape succesive a caracterelor sale (microscopice, de cultura, biochimice s.a.) si compararea acestora cu caracterele speciilor tip aflate in colectii de referinta si inscrise in determinatoare. Amanuntele nu sunt esentiale nici pen­tru studentii in medicina, nici pentru asistentele medicale, care trebuie sa ramana numai cu o ideea generala despre diferentierea microorganismelor unele de altele.

Aspectul microscopic

Bacteriile, fungii si protozoarele sunt studiate cu microscoape optice in produse patologice sau in culturi, fie in stare nativa, vie (preparate umede, necolorate), fie dupa fixare si colorare (preparate colorate).

Dintre preparatele umede mai larg utilizat este preparatul intre lama si lamela. Pe o lama de microscop se depune cu ansa o picatura de suspensie imicrobiana si se acopera cu o lamela. Se examineaza la microscop prin obiectiv uscat. Citoplasma este incolora si putin refringenta. De aceea in pre­parate umede microbii devin vizibili numai in conditii speciale de iluminare: reducerea diafragmei de apertura pentru a mari contrastul, examen pe fond negru sau cu contrast de faza. Preparatele umede ofera rapid detalii morfo­logice ale fungilor, protozoarelor sau spirochetelor si obiectiveaza mobilitatea bacteriilor sau protozoarelor.

Colorarea mareste contrastul intre structurile microbiene sau intre microbi si tesuturi. Ofera mai multe detalii morfologice decat preparatele umede. In vederea colorarii efectuam un frotiu adica etalam produsul microbian in strat subtire pe o lama de microscop, il uscam si il fixam. Fixarea, care o facem prin incalzirea lamei in flacara sau prin fixatori chimici (de ex, alcool metilic), omoara microbii si ii face mai aderenti pe lama.

Coloratiile simple utilizeaza un singur colorant si evidentiaza numai morfologia microbilor, dimensiunea, asezarea, prezenta sporilor sau capsulei. Flagelii sunt atat de subtiri incat pot fi observati numai prin coloratii speciale. Uzuala este coloratia cu albastru de metilen. Lama se pune pe stativul de colorare. Frotiul se acopera cu o solutie 3% de albastru de metilen, care se mentine 30 - 60 secunde. Se spala cu apa de robinet, se usuca si se exami­neaza la microscop prin obiectivul cu imersie. Toate elementele (leucocite, bacterii s.a.) apar colorate in albastru.

Virusurile pot fi observate numai la microscopul electronic pe sectiuni ultrafine dupa incluzionare intr-o masa plastica si umbrire cu metale grele sau colorare negativa Umbrirea se face in vid cu paladiu, platina sau un aliaj de aur-paladiu vaporizate sub unghi de cca 30°, astfel incat virionii apar lumi­nosi intr-o parte si isi proiecteaza umbra intunecata in partea opusa. In co­loratia negativa virionii inconjurati cu material electronodens (o sare de me­tal greu, ca fosfotungstatul de potasiu) raman transparenti la electroni. Se obtin astfel imagini pe care se pot urmari dimensiunea, forma si configuratia suprafetei virionilor (v. fig.1-12).

Reactiile de culoare.

Colorantii pot fi indepartati din microorganismele deja colorate prin solventi cum sunt alcoolul, acetona sau acizii. Prezenta anumitor compusi chimici in invelisurile unor microbi face organismele respective mai rezistente la decolorare. Organismele care nu retin colorantul, pentru a fi observate, trebuie recolorate. Daca recolorarea se face cu alt colorant, atunci diferenta intrfe cele doua categorii de organisme este usor de observat microscopic. Acesta este principiul coloratiilor diferentiale prin care urmarim reactiile de cu­loare ale microorganismelor.

Coloratia diferentiala Gram. Coloranti si reactivi necesari:

violet de metil sol. apoasa 0,2%;

sol. iodo-iodurata (Lugol);

amestec alcool-acetona;

sol. de fucsina Ziehl diluata 1/10.

Colorarea. Frotiul se acopera cu solutie de violet de metil. Se mentine un minut si se spala cu apa de robinet.

Mordantarea. Frotiul se acopera cu solutie Lugol, care dupa cateva secunde se varsa. Se acopera din nou cu solutie Lugol care se mentine 2 mi­nute. Se varsa si, fara a se spala, se trece la timpul urmator.

Diferentierea (decolorarea). Se acopera frotiul cu amestecul alcool-ace­tona si se dau usoare miscari de inclinare lamei. Dupa cca 5-10 secunde fro­tiul se spala cu apa de robinet.

Recolorarea Frotiul se acopera cu solutie de fucsina Ziehl diluata 1/10, se mentine 30 secunde. Se spala cu apa de robinet. Se usuca si se examineaza la microscop cu imersia.

Bacteriile gram-pozitive apar violete, iar cele gram-negative rosii. Leucocitele si celulele tisulare apar cu citoplasma roz si nucleul rosu. Astfel stafilococii si gonococii, care apar asemanatori pe un frotiu colorat simplu, pe frotiul colorat Gram se diferentiaza: stafilococii apar violeti, fiind gram-pozitivi, iar gonococii apar rosii, fiind gram-negativi.

Coloratia Ziehl-Neelsen depisteaza reactiile de culoare conferite de sub­stantele ceroase din peretele unor bacterii. Coloranti si reactivi necesari:

- solutie de fucsina fenicata Ziehl;

- solutie de alcool-clorhidric;

solutie 3 % de albastru de metilen.

Colorarea. Lama cu frotiul fixat se asaza pe stativul de colorare, se aco­pera cu solutia de fucsina Ziehl si se incalzeste cu ajutorul lampii de spirt pana la emitere de vapori (fara ca solutia sa fiarba). Se mentine 3 - 5 minute la aceasta temperatura. Dupa ce s-a racit, lama se spala abundent cu apa de robinet.

Decolorarea. Se acopera frotiul cu solutie alcool-clorhidric si se decoloreaza pana cand nu mai apar urme de colorant in solutie. In final frotiul tre­buie sa ramana, dupa spalare cu apa de robinet, alburiu.

Recolorarea. Frotiul se acopera cu solutie de albastru de metilen pen­tru 30 secunde. Se spala cu apa de robinet. Se usuca si se examineaza la mi­croscop cu imersie.

Bacilii acido-rezistenti apar rosii. Bacteriile neacido-rezistente si leucocitele apar albastre. Organisme acido-rezistente sunt bacilii tuberculozei, bacilii leprei si alte specii inrudite cu ei. Restul bacteriilor sunt neacido-re­zistente.

Caracterele de cultura

Microorganismele se diferentiaza dupa:

- capacitatea de a cultiva pe medii artificiale in cultivabile si necultivabile;

- exigentele nutritive: nepretentioase care cultiva pe bulion sau agar nutritiv, si pretentioase care cultiva numai pe medii imbogatite cu sange, cu unele zaharuri sau alte substante;

- aspectul coloniilor: diametrul, circumferinta, relieful, suprafata, culoarea, consistenta.

In acest fel microbiologul orienteaza identificarea catre un grup sau altul de microorganisme.

Testele biochimice

In cursul multiplicarii, microorganismele ataca prin enzimele lor dife­rite substante. Spectrul de activitati enzimatice difera de la o specie la alta si de la un gen la altul. Studierea acestui spectru are o importanta deosebita pentru identificarea microorganismelor, mai ales a bacteriilor. Activitatea enzimelor microbiene este urmarita prin modificarile pe care le produc asupra substratului corespunzator inglobat, de obicei, intr-un mediu de cultura . Asadar testele biochimice confirma identificarea prezumtiva bazata pe morfologia organismului, reactiile de culoare si caracterele de cul­tura.

Identificarea antigenica

Microorganismele contin proteine si carbohidrati specifici pentru o anumita specie sau grup de orga-nisme in cadrul speciei. Teoretic, chimistii pot diferentia aceste specificitati, dar cu consum de timp si cost enorm. Din fericire aceleasi informatii sunt obtinute mai simplu prin reactii antigen-anticorp. Proteinele si carbohidratii de specificitate a microorganismelor sunt antigene, adica ● injectate in organismul unui animal induc formare de anticorpi, substante proteice, ● cu care reactioneaza specific.

Practic, suspensii microbiene omorate sunt injec­tate repetat la animale de experienta, de ex, iepuri. In sangele animalelor sunt eliberati anticorpi, care raman in ser dupa coagularea sangelui. Obti­nem astfel seruri etichetate, care contin fiecare un anticorp cunoscut, co­respunzator microorganismului injectat. Aceste seruri devin reactivi pentru identificarea unui anumit microorganism printr-o reactie antigen-anticorp.

Cea mai folosita pentru identificarea microorganismelor este reactia de aglutinare. In serul imun corespunzator microorganismele devin aderente unele de altele, prin intermediul anticorpilor, si formeaza aglomerari care, pe o lama de microscop, se observa cu ochiul liber in cateva minute. In alte se­ruri aceleasi microorganisme raman dispersate, iar amestecul apare omogen. opac (fig. 1-20).

Fig. 1-20. reactia de aglutinare pe lama pentru identificarea unei salmonele. Suspensia bacteriana aglutineaza cu serul polivalent anti- Salmonella (A) si cu serul anti- Salmonella (grup C), dar nu su cu serul anti- Salmonella (grup B). Bacteria studiata este deci o Salmonella grup C.

Alte reactii antigen-anticorp folosite pentru identificarea microorga­nismelor sunt reactiile de precipitare, coloratie imunofluorescenta etc.