CERCETARE - OBTINEREA UNUI COLORANT ALIMENTAR DIN SFECLA ROSIE (BETA VULGARIS) PRIN EXTRACTIE CU SOLVENTI

1.1.Introducere

In categoria colorantilor intra acele substante ce se introduc in produsele alimentare pentru a restabili culoarea produsului alimentar care a fost afectata prin prelucrare, depozitare, ambalare si distributie sau care se introduc in produsele alimentare pentru ca cel ce consuma produsul alimentar sa identifice mai bine aroma produsului, respectiv pentru a colora un produs lipsit de culoare.

Colorantii sunt combinatii organice, naturale sau sintetice, ele insele colorante, dar care au si proprietatea de a colora. Pentru ca o combinatie chimica organica coloranta sa fie si materie coloranta, ea trebuie sa indeplineasca anumite conditii de solubilitate, de stabilitate la lumina sau alti agenti fizici sau chimici.

Un colorant alimentar ideal trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii:

sa nu fie toxic si sa nu fie cancerogenic la diferite niveluri de utilizare; sa nu contina impuritati toxice;

pentru a putea fi folosit, colorantul trebuie sa aiba dispersabilitate si/sau solubilitate adaptate la incorporarea sa in faza apoasa si/sau in faza lipidica din produsul alimentar;

sa nu altereze proprietatile organoleptice ale produsului alimentar in care se introduce;

sa fie stabil la lumina sub forma stabilizata;

sa nu fie afectat de temperaturile la care se face tratamentul termic al produsului (pasteurizare, fierbere, sterilizare);

sa fie stabil in timpul depozitarii;

sa nu reactioneze cu urmele de metale si nici cu agentii oxidanti sau reducatori;

caracteristicile sa fie reproductibile;

sa poata fi pus in evidenta in produsul alimentar prin tehnici analitice adecvate;

sa fie disponibil si relativ economic sub aspectul pretului;

sa fie aprobat prin legislatia sanitara in vigoare.

In conformitate cu datele existente in literatura de specialitate, sub denimirea de coloranti alimentari se inteleg acele substante colorate care se gasesc in mod natural in produsele comestibile, din care se obtin prin extractie, respectiv se obtin prin sinteza chimica (ex: carotenoidele, clorofile, antocianele, riboflavina, betainele etc.). [1]

Deoarece numarul colorantilor sintetici este limitat iar siguranta utilizarii unora este pusa sub semnul intrebarii, obtinerea si studierea unor pigmenti naturali pentru produse alimentare este de mare actualitate.

1.2.   Colorantul rosu din sfecla rosie

Sfecla rosie (Beta vulgaris L. var. Bikores monogerm) este o sursa foarte buna de pigmenti betalainici. Desi pigmentii similari pot fi intalniti si in alte plante, doar sfecla este cea care contine acest grup de pigmenti. Datorita concentratiei ridicate de pigment si a acceptarii pulberii de sfecla din 1960 drept colorant alimentar, pigmentii din sfecla prezinta un interes deosebit. [2]

1.2.1. Structura chimica a betalainelor

Betalainele, un termen introdus de Mabry si Dreiding (1968), se refera la pigmentii rosii (betacianine) si galbeni (betaxantine) din sfecla rosie. Principalul pigment rosu, betanina, este cel mai important pigment care ar putea fi considerat colorant alimentar, continand aproximativ 75 - 95% din continutul betacianinei din sfecla rosie (Dreiding 1961; von Elbe 1972)[3].

Structura betaninei a fost elucidata de Wilcox si este ilustrata in figura 1.

Fig. 1.1. Structura moleculara a betaninei,

principalul pigment rosu din sfecla rosie

Betanina, componentul major al betacianinelor din sfecla a fost cristalizata de Wyler si Dreiding (1957) si simultan de Schmidt si Schoenleben (1957). Structura detaliata a betaninei a fost stabilita de Wyler si colaboratori (1963).

Alte betacianine din sfecla sunt: izobetanina, izobetanidina, prebetanina si izoprebetanina. Structura izobetaninei este de C - 15 epimer a betanidinei.

Piatelli si colaboratorii (1964) si Wilcox si colaboratorii (1965) au aratat ca betanina si izobetanina sunt 5 - O - b - glicozidele betanidinei si respectiv izobetanidinei. Prebetanina si izoprebetanina sunt esterii monosulfat ai betaninei respectiv izobetaninei.

Degradarea alcalina a betanidinei produce acid 5,6 dihidroxiindol 2 carboxilic, acid 4 metil piridin - 2,6 dicarboxilic si ammoniac [4].

(1)                                           (2)

O cantitate mica de pigmenti galbeni (3) si (4) este de asemenea prezenta in colorantul alimentar.

(3) (4)

Metodele de determinare a concentratiei de pigmenti cuprind masuratori spectrofotometrice fie prin masurarea modificarii relative a absorbantei la lungimea de unda max. sau prin separarea si eluarea pigmentilor si calcularea concentratiei folosind coeficienti de repartitie.

Metoda spectrofotometrica elaborata de Nilsson (1970)[3] permite determinarea directa a betacianinelor si betaxantinelor fara separarea lor prealabila. Betanina are o A_max la 535 - 540 nm dar absoarbe si la A_max a vulgaxantinei I (476 - 478 nm), betaxantina majora din sfecla.

Deoarece absorbanta variaza cu concentratia, calcularea raportului A₅₃₈/A₄₇₆ conduce la determinarea concentratiei de betanina.

Vulgaxantina I nu absoarbe la A_max a betaninei, astfel ca absorbanta amestecului la aceasta lungime de unda se datoreaza doar betaninei. Rezultatele se exprima sub forma concentratiei de betacianine si betaxantine.

Drept colorant alimentar se poate utiliza atat extractul concentrat cat si pasta sau pulberea obtinuta prin atomizare. Ambele preparate au un continut pigmentar relativ scazut, de aceea pentru a obtine culoarea dorita sunt necesare mari cantitati.

Din valorile absorbantelor se remarca faptul ca betalainele sunt egale si/sau mai bune in puterea de colorare decat colorantii artificiali. Puterea tinctoriala a betaninei pure este aproximativ dubla fata de colorantii artificiali.

Aplicarea comerciala a betalainelor este conditionata de tehnologiile de obtinere a unor preparate cu un continut cat mai mare de colorant la un pret acceptabil. [5]

1.2.2. Proprietati

La folosirea colorantilor naturali trebuie sa se aiba in vedere urmatoarele proprietati functionale:

solubilitatea si activitatea apei mediului;

puterea coloranta;

sensibilitatea la pH;

sensibilitatea termica.

Toate betalainele sunt solubile in apa si de aceea prepararea extractelor de pigment este bazata in principiu pe solubilitate.

Principalul neajuns al pigmentului rosu din sfecla il constituie instabilitatea sa termica si la modificari ale pH-ului. La incalzire, betalainele (betacianine si betaxantine) se scindeaza cu eliberarea de acid betalamic (fig.1.2)[1].

Atunci cand colorantul se afla in solutie, la racirea acesteia dupa incalzire, are loc o revenire a culorii, dar nuanta se modifica spre violet purpur, deoarece proportia de vulgaxantina de culoare galbena se diminueaza.

Este cunoscut faptul ca o serie de factori din etapele de preparare, procesare si depozitare afecteaza stabilitatea culorii. Acesti factori includ: temperatura, pH-ul, lumina, prezenta sau absenta oxigenului, metalelor sau a altor substante chimice. Culoarea taiteilor de sfecla sufera modificari, dar aceasta este in general acceptabila datorita continutului pigmentar ridicat, care este sufucient de mare pentru a contracara pierderea ce apare pe parcursul taierii.

Fig. 1.2. Degradarea termica a betaninei

1.2.2.1. Factorii ce afecteaza stabilitatea betaninelor

1.2.2.1.1. Efectul pH-ului

Studiile de literatura [2,5] realizate pe suc, respectiv pe piure de sfecla, pe un domeniu de pH cuprins intre 2.0 si 9.0 au aratat ca spectrele solutiilor cu pH cuprins intre 4.0 si 7.0 sunt identice. Sub pH 4.0 (pentru solutii cu pH = 2) se constata o usoara deplasare a maximului spre l mai mici (535 nm fata de 537 nm) iar intensitatea culorii scade. Spectrul se largeste in domeniul 575 - 650 nm si culoarea se modifica de la rosu la rosu - violet.

Peste pH = 7.0 absorbanta se deplaseaza spre lumgimi de unda mai mari iar intensitatea scade si in acest caz. Cresterea absorbantei apare la 575 - 650 nm si 400 - 450, modificarile spectrale datorandu-se modificarii culorii de la rosu la violet. Peste pH 10.0 intensitatea absorbantei in domeniul de 540 - 550 nm continua sa scada iar absorbanta in domeniul 400 - 460 nm creste, cu o rapida schimbare a culorii in galben (Nilsson 1970; von Elbe 1974).

Modificarile de culoare s-au masurat pentru solutii preparate din 1 ml solutie betanina (concentratie 0.4 mg/100 ml) si 4 ml solutie tampon prin citirea absorbantei in domeniul 400 - 650 nm la temperatura de 4⁰C.

S-a urmarit de asemenea si influenta concomitenta a timpului de depozitare. S-a constatat ca in cazul probelor depozitate 7 zile nu se remarca modificari in domeniul de pH = 3 - 7 dar absorbanta scade la valori de pH < 3 si pH > 7. Stabilitatea culorii este remarcabila in domeniul de pH = 4 - 5. (tabel 1.1.)

Tabel 1.1. Influenta pH-ului asupra stabilitatii culorii solutiilor de betanina

1.2.2.1.2. Efectul temperaturii [2]

Solutiile de betanina incalzite pe intervale variabile de timp sufera o degradare graduala a culorii rosii si aparitia culorii maro deschis.

Modificarea de culoare s-a studiat prin calculul descresterii continutului de betanina si a procentului ramas dupa tratamentul termic cu relatia:

%R = [mg betanina la timpul x / mg betanina la t = 0 (initial)] * 100

R se reprezinta functie de timp intr-o diagrama semilogaritmica. Dependenta liniara obtinuta indica faptul ca degradarea termica a betaninei decurge conform unei cinetici de ordinul 1. Pentru timpul de injumatatire a pigmentului s-a stabilit relatia:

k = constanta de viteza, obtinuta prin multiplicarea pantei dreptelor cu    -2.303.

Datele de literatura obtinute sunt prezentate in tabelul 1.2. Acestea indica faptul ca stabilitatea betaninei este mai mare intre pH 4 si 5.0. Stabilitatea betaninei din sucul de sfecla in domeniul de pH 3 - 7 este similara stabilitatii solutiilor de betanina. Cu toate acestea la pH 5 stabilitatea sucului este mai mare, ceea ce indica un efect protector al componentilor sucului.

CE = eroarea maxima calculata.

Tabelul 1.2. Viteza de degradare a solutiei de betanina si suc de sfecla

functie de pH la 100 1⁰C:

Datele de literatura referitoare la viteza de degradare in timp sunt prezente in tabelul 1.3.

Tabelul 1.3. Viteze de degradare a solutiei de betanina functie de temperatura si pH:

Tabelul 1.4. Procentul mediu de betanina continut in piureul de sfecla:

Studiile efectuate asupra piureului de sfecla indica faptul ca viteza de degradare este similara in ambele cazuri, valorile constantei de viteza k fiind la 100⁰C aproape identice 0.02 respectiv 0.024. Acest lucru exprima efectul protector a componentilor la pH-ul natural (4.9).

In consecinta, betanina pura nu poate fi utilizata ca un colorant alimentar datorita labilitatii sale termice. Desi exista un efect protector natural in sucul respectiv piureul de sfecla, utilizarea acestora este limitata la procese care nu necesita prelucrare termica sau aceasta este de foarte scurta durata

1.2.2.1.3. Influenta luminii si/sau aerului asupra culorii [2]

Cercetarile privind influenta luminii/aerului, realizate prin depozitarea solutiei de betanina pH = 7 in aer sau N₂ cu sau fara expunere la lumina timp de 6 zile la 15⁰C au evidentiat faptul ca prezenta aerului, respective luminii creste viteza de degradare, efectele celor 2 factori fiind cumulative. Acest lucru impune evitarea expunerii indelungate la lumina si aer a produselor cu continut de betanina.

1.2.2.1.4. Efectul activitatii apei [6]

Unul din factorii ce afecteaza stabilitatea betaninei este si umiditatea.

Activitatea apei este definita ca raportul dintre presiunea de vapori a apei intr-un sistem specific si presiunea de vapori a apei pure la aceeasi temperatura. Activitatea apei se noteaza cu a_H2O.

Studiul de literatura indica o crestere a stabilitatii betaninei la 75⁰C o data cu descresterea activitatii apei de la 1.0 la 0.37. Timpul de injumatatire T_1/2 a betaninei este de cca. 4 ori mai mare la a = 0.37 decat in cazul in care a = 1. (tabel 1.5).

Aceasta stabilitate crescuta explica utilizarea cu succes a betaninei la colorarea deserturilor gelatinoase si sugereaza si alte domenii de utilizare in alimente cu umiditate joasa sau moderata.

Tabel 1.5. Timpul de injumatatire functie de a_H2O la 75⁰C:

1.2.2.1.5. Efectul radiatiilor asupra stabilitatii betalainelor [7]

Expunerea pigmentilor rosu intens si galben la radiatiile gama si ultraviolete conduc la o pierdere in culoare. Iradierea gama de 50 - 100 krad a cauzat o scadere a absorbtiei in spectrul vizibil la lungimea de unda maxima. Dozari in exces de 100 krad au dus la pierderi totale de culoare.

Efectul protector a componentilor sucului si piureului precum si a unor componenti ai produselor alimentare ce contin betanina ca pigment indica faptul ca in anumite conditii acesti compusi pot fi utilizati in industria alimentara.

1.2.3.Tehnologia de obtinere

Colorantul rosu de sfecla se poate obtine atat prin presarea taiteilor de sfecla si stabilizarea sucului obtinut prin fermentatie cat si prin extractie cu solventi

1.2.3.1. Obtinerea sucului de sfecla [8]

Colorantul alimentar a fost obtinut prin zdrobirea sfeclelor rosii (Beta vulgaris) si presarea materiei crude, scotand sucul prin acidifiere si fierbere la presiune scazuta. Pentru a preveni oxidarea colorantului si pentru a creste calitatea acestuia procesarea se realizeaza in atmosfera de gaz inert (azot).

Evaporarea sucului are loc la presiune scazuta, timp de 1 - 2 h, in atmosfera de azot.

Pentru a preveni activarea enzimelor oxido-reducatoare, procesul de zdrobire si presare se realizeaza la temperatura de 5 - 10⁰C. Sucul este acidifiat cu ajutorul solutiei de acid citric 0.1 - 1.0%, respectiv solutie de HCl 1.0 - 1.5%. [9]

O alta metoda de obtinere a sucului de sfecla consta in zdrobirea si presarea sfeclelor pentru obtinerea sucului si fermentarea acestuia cu Saccharomyces oviformis (cultivat pe must de struguri) la pH = 4.8 - 5.0. Astfel, prin presarea sucului in timpul fermentarii cu Saccharomyces oviformis la temperatura de 30⁰C si pH 4.8 pentru 24 h se inregistreaza pierderi ale pigmentului de numai 13 - 14%.

Dupa incheierea fermentatiei biomasa este separata si folosita ca aditiv alimentar. Sucul obtinut a fost concentrat la temperatura de 50 - 55⁰C, rezultand un colorant concentrat care poate fi depozitat la 0 - 4⁰C pentru cateva luni. [8,9]

1.2.3.2. Obtinerea betalainelor prin extractie cu solventi

Pentru extractia pigmentilor betalainici din sfecla se aplica extractia cu diversi solventi: apa, solutie HCl, solutie acid citric, solutie acid ascorbic, amestec de acid citric si acid ascorbic, alcool etilic, amestec de acid citric si alcool etilic, amestec HCl si alcool etilic [10].

Indiferent de diferentele dintre materia prima sau compozitia pigmentilor extrasi, este bine sa se combine mai multe metode de extractie, intrucat deocamdata lipsesc informatiile comparative despre influenta tipului de solvent asupra extractiei pigmentilor din taiteii din sfecla si nu sunt stabiliti parametrii optimi ai procesului de extractie.

Procedeele de extractie au fost realizate atat prin contactare simpla cat si diferentiala, utilizandu-se un extractor tubular prevazut cu un transportor elicoidal.

1.2.4. Purificarea produsului brut

80% din substanta uscata din sucul de sfecla contine carbohidrati fermentabili si azot, iar o fermentare cu drojdii pare o solutie rezonabila de descrestere a solidelor totale si crestere a betacianinei concentrate pe un mediu solid [12].

Fermentarea sucului de sfecla rosie ultrafiltrat cu Candida utilis in conditii partial anaerobe, a determinat reducerea substantiala a substantelor uscate, rezultand o crestere de 5 - 7 parti a betacianinei raportata la substanta uscata. A fost obtinut un continut de 6 - 8% betacianina in produsul final uscat. Carbohidratii fermentabili, azotul aminic si 80% din azotul Kjeldahl au fost asimilati de Candida utilis dupa 6, 5 ore de fermentatie prin mentinerea pH-ului la 5.0 cu solutie de NaOH si HCl. Dupa uscare, produsului ii lipsesc caracteristicile si aroma fainii de sfecla si este solubil in apa.

In urma acestor experimente, Adams (1974) a concluzionat urmatoarele:

utilizarea NH₃ pentru a mentine valoarea pH-ului dorita, a scazut utilizarea azotului in timpul fermentatiei;

un tratament cu pectinaza inaintea fermentarii ar reduce solidele totale dupa fermentare;

enzimele proteolitice nu au crescut utilizarea proteinelor;

tratamentele cu hidrolizate enzimatice in conditii anaerobe inainte de fermentare au produs pierderi substantiale de betacianine;

sfeclele cu continut ridicat de betacianina au crescut pe medii solide.

Sucul de sfecla rosie este filtrat, supus schimbului anionic cu solutie de NaCl, iar produsul ultrafiltrat si concentrat contine betanina si vulgaxantina I. Astfel, 108.0 l suc de sfecla (16.8 g betanina, 16.0 g vulgaxantina) este trecut prin Duolite A 171 P (forma Cl^-) -  coloana schimbatoare de anioni la 25 l/h cu solutie NaCl, pentru a obtine 286 mg betanina si 289 mg vulgaxantina/l (randament 85%). Dintr-o solutie (50 l) continand 5% NaCl, 800 mg betanina si 550 mg vulgaxantina/l, a fost ontinut un concentrat prin ultrafiltrare cu o membrana DDS - 865 la 45 atm si 8 l/min. Acest concentrat a fost redus la 12 l continand 5% NaCl, 7817 mg betanina si 5246 mg vulgaxantina/l [13].

Purificarea si separarea pigmentilor poate fi realizata prin tehnici cromatografice si/sau elecroforeza [3,14].

1.2.5. Domenii de utilizare

Utilizarea betaninei drept colorant alimentar natural este admisa de FAO cu restrictii: arsen maxim 5 mg/kg si plumb 20 mg/kg, sub forma extractului brut. [15]

Rosul de sfecla se utilizeaza la fabricarea bauturilor nealcoolice, produselor de patiserie si panificatie, deserturilor pe baza de gelatina, budincilor, supelor, amestecurilor pulbere. Fiind sensibil la caldura si la pH, nu da rezultate satisfacatoare la utilizare in preparatele din carne. [1,4,14]

Poate fi utilizat drept colorant pentru carnea tocata in amestec cu derivate proteice texturate, destinate obtinerii de perisoare, chiftele, hamburger, la care se cere culoarea rosie pentru amestecul ca atare, dar care se poate brunifica in timpul tratamentului termic (ceea ce este de dorit).

1.3. Extractia lichid - solid [16]

Prin spalare extractiva se intelege procesul de solubilizare preferentiala a unuia sau mai multor componenti ai amestecului de constituenti aflat in solidul supus contactarii cu un mediu lichid adecvat.

Extractia lichid - solid, cunoscuta si sub denumirea de spalare extractiva sau lixiviatie, este un procedeu larg utilizat in variate domenii industriale, de la industria alimentara (obtinerea in unele cazuri a uleiurilor vegetale si animale, turte sau deseuri de origine animala sau vegetala, a zaharului din sfecla si trestie de zahar, a cofeinei din cafea, a uleiurilor eterice din plante etc.) la industria metalurgica sau biotehnologie.

1.3.1. Principii fundamentale in extractia lichid - solid

Principiul extractiei unui component itul solid (solut) aflat intr-o masa solida consta in dizolvarea treptata a acestuia incepand de le suprafata particulei, creand o structura poroasa in interiorul solidului, urmata de patrunderea solventului in interiorul particulei, dizolvarea solutului si saturarea sa in apropierea frontului de dizolvare, urmata de difuzia de solut prin porii umpluti cu solvent spre suprafata particulei solide, apoi difuzia in masa exterioara de solvent, formand extractul.

1.3.2. Factorii specifici extractiei lichid - solid

Eficacitatea procedeului extractiv este influentata de o serie de factori care depind de:

natura fazei solide;

natura solventului utilizat pentru extractie si echipamentul de lucru;

conditii de operare si geometri utilajului.

Natura si proprietatile solidului supus extractiei determina mersul procedeului extractiv. Structura solidului in functie de natura sa, poate fi poroasa, compacta sau celulara. Dimensiunea particulelor poate influenta viteza de extractie in mai multe moduri. Cu cat dimensiunea va fi mai mica, cu atat parcursul difuzional intern va fi mai mic iar suprafata de contact dintre cele doua faze (lichida si solida) va fi mai mare si, in consecinta, si viteza de transfer de masa va creste. Prin utilizarea insa, de particule de dimensiuni foarte mici, poate apare pericolul ingreunarii separarii fazelor, respectiv al drenarii reziduului.

Daca solidul supus extractiei are o structura celulara (cazul materialelor vegetale sau animale) ce inglobeaza solutul intracelular, viteza de extractie va fi semnificativ diminuata de rezistenta peretelui celular prin care solutul va trece osmotic. Pentru acest tip de materiale, maruntirea este necesara pentru a favoriza patrunderea solventului pana la nivel celular.

Natura solventului utilizat in operatiile de extractie, determina nu numai conditiile tehnologice de realizare a procesului, dar si economicitatea acestuia. In alegerea solventului trebuie sa se tina seama de urmatoarele aspecte:

selectivitate ridicata fata de solut;

temperatura de fierbere, proprietati calorice si presiune de vapori corespunzatoare pentru a permite o separareusoara de solut si a evita pierderile de solvent prin vaporizare;

densitate relativa si vascozitate scazuta pentru a permite o mai buna penetrare in structura solida si sa faciliteze circulatia fazei lichide in utilajul de extractie;

toxicitate si pericol de inflamabilitate cat mai reduse;

sa fie necoroziv;

recuperare usoara, atat din extract cat si din reziduu, si de reutilizare;

sa fie accesibil si la un pret de cost cat mai scazut.

De regula, alegerea solventului se face, pentru fiecare caz in parte, prin acceptarea unui compromis intre criteriile mai sus mentionate.

In ceea ce priveste conditiile de operare un rol esential il are temperatura la care se realizeaza extractia. In mod obisnuit este de dorit ca extractia sa se realizeze la temperatura maxima posibila deoarece solubilitatea materialului ce urmeaza a fi extras creste cu temperatura, permitand obtinerea unor solutii concentrate. Concomitent creste si valoarea coeficientului de difuzie, ceea ce determina o crestere a vitezei de extractie. Temperatura de lucru este limitata, insa, din considerente tehnologice (evitarea unor reactii chimice ireversibile dintre solut si solvent, evitarea extractiei unor specii nedorite) sau economice (pierderi de solvent prin evaporare).

Conditiile hidrodinamice din utilajul de extractie sunt, de asemenea, importante, deoarece conduc la intensificarea etapei de difizie externa si la prevenirea sedimentarii particulelor solide, in cazul operarii discontinue in recipiente cu amestecare.

In ceea ce priveste modul de operare si echipamentul de lucru extractia lichid - solid se poate realiza in regim discontinuu sau semicontinuu, cand operarea este discontinua, respectiv in regim continuu.

Alegerea metodei de extractie este determinata de natura si concentratia de solut, de distributia sa in faza solida, precum si de marimea particulelor acesteia. [16].